端粒酶逆转录酶在急性坏死性胰腺炎大鼠中性粒细胞凋亡中的作用

任大宾 杨志文

1上海市松江区中心医院消化内科，上海 201600；2上海市松江区中心医院药剂科，上海 201600

SAP是由胰腺局部炎症所致，累及全身炎症反应综合征，继而造成多器官功能障碍综合征的临床危重病。“白细胞过度激活学说”是SAP发病的重要机制之一。胰腺组织自身消化释放内源性物质，激活中性粒细胞，使得其凋亡延迟，继而释放大量炎症因子，引发“瀑布”效应，致使SAP患者出现全身炎症反应综合征[1-2]。传统观点认为，端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)仅在肿瘤细胞、生殖细胞、造血细胞中表达[3]。2008年Lepreux等[4]首次发现TERT在中性粒细胞胞质中表达。近年有研究报道，冠心病[5-6]、原发性卵巢功能不全患者[7]中性粒细胞TERT水平异常表达，中性粒细胞凋亡延迟，但迄今为止，未见SAP时中性粒细胞TERT表达水平的相关报道。因此，本研究探讨TERE对急性坏死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis，ANP)大鼠中性粒细胞凋亡的影响。

材料与方法

一、动物与分组

24只SPF级Sprague-Dawley雄性大鼠由上海斯莱克实验动物有限公司提供，许可证号SCXK(沪)2017-0005。大鼠禁食12 h，自由饮水，按数字表法随机分为正常对照组，ANP 3、6 h组[8]和TERT抑制剂BIBR1532干预组(BIBR1532组)，每组6只。ANP组大鼠采用胰胆管逆行注射5%牛磺胆酸钠(1 ml/kg)造模，分别在造模后3、6 h处死，经心脏采血。BIBR1532组大鼠在造模前腹腔注射2 mg/kg TERT抑制剂BIBR1532(美国EMC公司)，每周3次，连续2周，于造模3 h后处死，经心脏采血。正常对照组大鼠未经任何处理。取各组大鼠胰腺组织，置10%甲醛溶液中固定。

二、方法

1．外周血中性粒细胞分离：采集的大鼠血样本经1%葡聚糖沉淀红细胞，取上层富含粒细胞的血浆，按1∶1容积加入大鼠淋巴细胞分离液，以1 500 r/min离心20 min，离心半径9 cm。通过低渗溶液溶解红细胞，Percoll密度梯度离心法分离中性粒细胞，采用台盼蓝、瑞氏染色检测中性粒细胞存活率和纯度。

2．中性粒细胞TERT mRNA检测：应用荧光定量PCR法检测中性粒细胞的TERT mRNA表达量。TERT正向引物序列为5′-CAGATGCGACCCCTATTC-3′，反向引物序列为5′-TGTAACCGGAGCAAACTC-3′；内参GAPDH正向引物序列为5′-TATCGGACGCCTGGTTAC-3′，反向引物序列为5′-CTGTGCCGTTGAACTTGC-3′。引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。反应条件：95℃ 10 min，95℃ 15 s、60℃ 15 s，40个循环。通过仪器自带软件获取Ct值，以公式2-ΔΔCt计算mRNA相对表达量。

3．中性粒细胞TERT蛋白及凋亡相关蛋白检测：采用蛋白质免疫印迹法检测TERT蛋白及凋亡相关蛋白Bcl-xL、Bax表达量。抗TERT、Bcl-xL、Bax单克隆抗体购自英国abcam公司，工作浓度均为1∶1 000；辣根过氧化物酶标记的二抗购自上海碧云天生物技术有限公司，工作浓度为1∶200。最后ECL发光，X片曝光、显影、定影。Image J软件分析各条带灰度值，以目的条带与内参条带的灰度值比为蛋白相对表达量。

4．中性粒细胞凋亡检测：取含2×106/ml中性粒细胞的RPMI1640培养液500 μl，均匀接种于24孔板，常规培养16 h后，依次加入2.5 μl Annexin V-FITC 和5.0 μl碘化丙啶(PI)溶液，上流式细胞仪检测中性粒细胞凋亡。

5．血清TNF-α、IL-6检测：收集与分离大鼠外周血血清，ELISA检测试剂盒 (美国eBioScience 公司)检测各组大鼠血清TNF-α、IL-6水平，按试剂盒说明书操作。

6．胰腺组织病理学检查：取甲醛溶液固定的胰腺组织标本，常规石蜡包埋、切片，苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察组织病理改变。

三、统计学处理

结 果

一、各组大鼠中性粒细胞TERT mRNA及蛋白的表达

分离后的大鼠中性粒细胞瑞氏染色显示细胞核呈杆状或2～5分叶状，符合中性粒细胞特征，纯度>95%(图1A)；台盼蓝染色显示极少量细胞呈淡蓝色，中性粒细胞存活率>97%(图1B)。

图1 外周血中性粒细胞特征 1A 瑞氏染色(×1000)；1B 台盼蓝染色(×100)

正常对照组、ANP 3 h组、ANP 6 h组、BIBR1532组外周血中性粒细胞TERT mRNA表达量分别为1.03±0.26、3.31±1.07、5.21±0.78、1.95±0.49，TERT蛋白表达量分别为0.09±0.03、0.43±0.12、0.58±0.11、0.22±0.07(图2)，ANP 3、6 h 组TERT mRNA及蛋白表达水平高于正常对照组，而BIBR1532组低于ANP 3 h组，差异均有统计学意义(t值分别为5.08、12.52、2.82，6.92、7.69、4.05；P值均<0.05)。表明TERT mRNA及蛋白在ANP大鼠外周血中性粒细胞中高表达。

注：ANP为急性坏死性胰腺炎；TERT为端粒酶逆转录酶；BIBR1532为端粒酶逆转录酶抑制剂图2 正常对照组(1)、ANP 3 h组(2)、ANP 6 h组(3)、BIBR1532组(4)大鼠外周血中性粒细胞TERT蛋白表达

二、各组大鼠中性粒细胞Bcl-xL、Bax蛋白的表达

正常对照组、ANP 3 h组、ANP 6 h组、BIBR1532组中性粒细胞的Bcl-xL蛋白表达量分别为0.19±0.05、0.50±0.07、0.85±0.04、0.40±0.11，Bax蛋白表达量分别为0.29±0.08、0.23±0.03、0.17±0.02、0.43±0.12(图3)。与正常对照组比较，ANP 3、6 h组的Bcl-xL表达量上升(t值分别为7.75、16.30，P值均<0.05)，而Bax表达量下降(t值分别为4.22、6.74，P值均<0.05)；与ANP 3 h组比较，BIBR1532组Bcl-xL表达量下降(t=5.42，P<0.05)，而Bax表达量上升(t=5.59，P<0.05)。表明TERT表达量升高则抑制ANP大鼠外周血中性粒细胞凋亡。

三、各组大鼠中性粒细胞凋亡率

中性粒细胞体外培养16 h后，正常对照组、ANP 3 h组、ANP 6 h组、BIBR1532组外周血中性粒细胞凋亡率分别为(10.03±0.74)%、(7.99±0.27)%、(6.65±0.36)%、(22.98±2.86)%。ANP 3、6 h 组中性粒细胞凋亡率低于正常对照组，而BIBR1532组高于ANP 3 h组，差异均有统计学意义(t值分别为4.52、7.27、12.63，P值均<0.05，图4)。

注：ANP为急性坏死性胰腺炎；TERT为端粒酶逆转录酶；BIBR1532为端粒酶逆转录酶抑制剂图3 正常对照组(1)、ANP 3 h组(2)、ANP 6 h组(3)、BIBR1532组(4)大鼠外周血中性粒细胞Bcl-xL、Bax蛋白表达图4 正常对照组(4A)、ANP 3 h组(4B)、ANP 6 h组(4C)、BIBR1532组(4D)大鼠外周血中性粒细胞流式细胞分析图

四、各组大鼠血清TNF-α、IL-6水平

正常对照组、ANP 3 h组、BIBR1532组血清TNF-α水平分别为(96.67±27.12)、(382.30±46.33)、(206.88±36.42) ng/L，IL-6水平分别为(43.34±14.50)、(134.21±16.13)、(88.06±13.05)ng/L，ANP 3 h组TNF-α、IL-6水平均高于正常对照组，BIBR1532组TNF-α、IL-6水平均低于ANP 3 h组，差异均有统计学意义(t值分别为22.57、12.63,17.77、9.43；P值均<0.05)。表明TERT高表达可上调血清TNF-α、IL-6水平。

五、各组大鼠胰腺组织的病理改变

正常对照组大鼠胰腺组织结构完整，无间质充血、出血和腺泡细胞坏死。ANP组大鼠胰腺组织可见大量的炎症细胞浸润，小叶间隔增宽、结构破坏，组织坏死。BIBR1532组大鼠胰腺组织病理改变较ANP组明显改善(图5)。表明TERT高表达可加重ANP大鼠胰腺组织的炎症损伤。

注：ANP为急性坏死性胰腺炎；BIBR1532为端粒酶逆转录酶抑制剂图5 正常对照组(5A)、ANP 3 h组(5B)、ANP 6 h组(5C)、BIBR1532组(5D)大鼠胰腺组织病理改变(苏木精-伊红染色 ×400)

讨 论

端粒酶为自身携带模板的核蛋白逆转录酶，由TERT、端粒酶RNA、端粒酶相关蛋白3个主要的亚单位组成。端粒酶是细胞凋亡延迟的关键信号分子[9]，通过端粒和非端粒保护机制，维持端粒长度和改善线粒体功能，抑制细胞凋亡。TERT是端粒酶活化的限速酶，其表达程度反映端粒酶活性水平[10]。

研究发现，动脉粥样硬化大鼠在持续炎症递质刺激下，其动脉组织的端粒酶活性增加13倍[5]；不稳定型心绞痛患者外周血中性粒细胞端粒酶活性较健康者增加2倍，从动脉粥样硬化患者的硬化斑块分离出的中性粒细胞中端粒酶活性增加更显著，其中35%患者的端粒酶活性增加50倍[6]；原发性卵巢功能不全患者外周血中性粒细胞的端粒酶活性下降3倍，加速细胞衰老过程，进而导致卵巢内卵泡的耗竭或功能失常[7]。

2011年von Figura等[11]报道端粒酶基因敲除小鼠胰腺外分泌腺的再生能力降低，显示端粒酶参与急性胰腺炎的发生和发展。本研究结果显示，ANP 大鼠外周血中性粒细胞的TERT mRNA及蛋白表达上调，细胞凋亡的时间延长，抗凋亡蛋白Bcl-xL表达水平上升，而促凋亡蛋白Bax表达水平下降，同时外周血 TNF-α、IL-6 等炎症细胞因子水平也显著升高。提示BIBR1532显著下调中性粒细胞的TERT mRNA及蛋白表达，促进中性粒细胞凋亡，降低外周血炎症因子水平，有效缓解ANP大鼠胰腺组织的炎症损伤。然而，本研究未行BIBR1532时间及剂量依赖性效应观察，存在一定的局限性。

利益冲突所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明任大宾：实验操作、论文撰写、数据整理；杨志文：研究指导、论文修改、经费支持