基于生物信息学方法的胰腺癌组织趋化因子CCL2相关差异基因表达及其预后价值

周锐 余运霖 焦鑫 余枭 高文哲 张先林

1三峡大学附属仁和医院普外科，宜昌 443001；2中南大学湘雅三医院肝胆胰外科，长沙 410000

【提要】 通过TCGA数据库中CCL2基因表达谱，对其差异表达基因(DEGs)做相关性分析，然后与临床生存信息结合，经过建模验证后获得预后相关DEGs，进而探讨DEGs部分基因的作用及对胰腺癌患者生存的影响。结果表明，CCL2相关性基因 在胰腺癌中扮演重要角色，其低表达与胰腺癌患者的预后成正相关。

趋化因子是一类由细胞分泌的小细胞因子或信号蛋白，具有诱导附近反应细胞定向趋化的能力[1]，是主导细胞迁徙的关键调节剂，对恶性肿瘤的发展有极大影响。CCL2是趋化因子CC亚家族中的重要成员，为促进单核细胞及巨噬细胞迁徙的关键因子之一，已经证实，CCL2在多种肿瘤发展进程中发挥作用[2-5]，通过抑制细胞凋亡、坏死和自噬等过程提高癌细胞的存活能力[6-8]，并在肿瘤微环境中与其受体相互作用，调节单核细胞的趋化性从而导致肿瘤的发展。然而，CCL2在胰腺癌中的作用机制尚不明确。本研究通过生物信息学分析CCL2及其相关差异表达基因，探讨它们在胰腺癌组织中的表达及其与患者预后的相关性。

一、材料与方法

1．数据集的选择：从肿瘤基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA,)数据库下载178例胰腺癌患者的基因表达谱，从TCGA数据库的连接网站UCSC XENA下载178例胰腺癌患者对应的完整临床数据。

2．基因表达差异分析及相关性分析：根据CCL2基因表达量中位数，将178例患者分为高、低表达两组，以logFC=1且P<0.05为标准，采用R/Bioconductor软件的limma包对比筛选差异表达基因(differentially expressed genes，DEGs)。采用R软件的corplot包对TCGA样本与CCL2基因进行相关性分析，得到各个基因的相关系数，以相关系数的绝对值0.15为界限，选取相关基因与DEGs的交集，得到相关DEGs。根据178例患者的中位生存时间和生存状态，采用R软件的ezcox包进行批量COX回归分析，以P<0.05为差异有统计学意义，筛选与预后相关的DEGs。

3．预后相关DEGs功能富集分析：使用R/Bioconductor软件的clusterprofiler包对预后相关DEGs进行功能富集分析，包括基因本体(gene ontology,GO)分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes,KEGG)通路富集分析，其中GO包括细胞成分、分子功能和生物学过程3个部分。

4．风险预测模型的建立与评估：采用R软件的glmnet包，用Lasso方法筛选变量，建立Cox回归模型，并计算基因的相关回归系数，获得预后相关DEGs模型。然后二次建模，根据回归系数加权建立胰腺癌预后风险评估公式，绘制生存曲线和受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic, ROC)，计算曲线下面积(area under the curve, AUC)，并将预测模型可视化为列线图。

5．统计学处理：采用R软件(3.6.0版本)进行统计学分析。应用Wilcoxon秩和检验分析CCL2关键相关基因在胰腺癌组织中的差异表达，计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验。基因间的相关性采用Spearman相关分析，0.1≤|r|≤1.0时定义为存在相关；生存曲线采用Kaplan-Meier法和Log-rank检验。P<0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1．CCL2相关差异表达基因及功能和通路富集分析：通过差异分析及相关性分析，得到上调基因60个，下调基因304个，相关DEGs 223个(图1A)。结合患者中位生存时间和生存状态，进行多基因的COX回归分析，得到与患者预后相关的DEGs 20个。GO功能富集分析和KEGG通路富集分析发现，20个DEGs主要富集对IL-1、TNF的应答和G蛋白偶联受体结合位点上以及干细胞黏附分子、趋化因子信号通路上(图1B、1C)。

图1 胰腺癌CCL2相关差异表达基因的火山图(1A)及胰腺癌CCL2相关差异表达基因功能富集图(1B)和通路富集图(1C)

2．预后相关DEGs风险模型及验证：Lasso Cox回归分析筛选得到12个基因，分别为VTCN1、RXRG、HSD11B1、RELN、LCN6、MUC15、C1S、CLDN10、TRARG1、CCL18、SLC7A10、ZNF831，其中VTCN1、HSD11B1、C1S为高风险基因；Kaplan-Meier单变量分析结果显示，高风险基因与患者生存期短有关。根据回归系数得到患者的风险评分，并将患者分为高、低风险组，Kaplan-Meier法进行生存分析结果显示，两组患者生存期差异有统计学意义(P<0.05)，高风险组患者生存期明显缩短(图2A)。预测模型的ROC曲线见图2A，AUC值为0.716，表明该模型可预测胰腺癌患者的预后(图2B)。将预测模型可视化为生存预测列线图(图2C)。

图2 胰腺癌高、低风险组患者的生存曲线(2A)及生存预测的ROC曲线(2B)和列线图(2C)

讨论胰腺癌恶性程度高，预后差，了解其肿瘤免疫微环境，对疾病的干预和预后的判断具有重要意义。有证据表明，高CCL2水平与更具侵袭性的恶性肿瘤、更高的转移概率和更广泛的癌症预后相关[9]。CCL2在聚集肿瘤相关巨噬细胞中发挥作用，促使胰腺癌细胞重新改变其代谢途径耐以生存，并使得胰腺癌细胞能够在缺氧的条件下增殖[10-12]。本研究通过GO功能和KEGG通路富集分析发现，CCL2相关因子除了作用于常规趋化因子通路外，还聚集干细胞黏附、IL-1的免疫反应和G蛋白受体的结合，可能与肿瘤的浸润、远处转移、逃离细胞免疫监视等方面有关。根据CCL2相关性因子及Lasso Cox回归分析筛选的12个建模基因中，ZNF831被报道富集于CD4+T细胞浸润[13]，进而可能参与调控胰腺癌CD4+T细胞的基因表达；SLC7A10属于溶质载体家族，其过表达降低了ROS生成并增加了线粒体呼吸的能力，促使脂肪细胞肥大，促进肥胖和胰岛素抵抗，进而引起血糖的变化，使得胰腺癌的风险增加[14]；而同样，作为趋化因子家族的CCL18也能促使肿瘤的转移[15]；RXRG高表达会引起血脂的异常风险增加，而血脂和血糖的变化与胰腺癌有着密切关系[16]。CCL2由于能够激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路，阻碍T细胞增殖，伴随着持续的免疫抑制，通过促进髓源性抑制细胞(M-MDSCs)的免疫抑制能力，从而促使肿瘤生长和增殖[17]。血浆CCL2水平的升高是大肠癌复发的预测生物标志物[18]。趋化因子CCL2的表观遗传沉默抑制巨噬细胞浸润以促进肿瘤的发展[19]。本研究结果显示，相比低风险组患者，高风险患者生存期明显缩短(P<0.05)；ROC曲线示该模型可以预测胰腺癌患者的预后。该模型基于各类基因的总体表达量，更符合当今的系统治疗理念。

同时，本研究也存在一些缺陷。首先，本研究是通过生物信息学构建的预后预测模型，无外部的实验数据验证，临床实际应用价值有限。其次，由于TCGA的样本数量局限性，不能完整地阐述CCL2作用机制引起相关基因的差异性表达。最后，需要更多的病例数量独立队列研究来验证。

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