柚皮素对慢性胰腺炎小鼠胰腺纤维化及胰腺星状细胞活化、增殖和凋亡的影响

吕彦玮 王丽娟 黄仁前 林曦 韩超 胡良皞 李兆申

海军军医大学第一附属医院消化内科，上海 200433

进展性胰腺纤维化为CP最主要的病理学特征。研究表明，胰腺星状细胞(pancreatic stellate cells, PSCs)活化是胰腺组织纤维化初始阶段的关键效应细胞[1]。胰腺急性损伤和炎症发生后，静息状态的PSCs可被组织微环境中各种损伤相关刺激因子和促炎因子(如TGF-β、PDGF、TNF-α、IL-1β、IL-6等)激活，转化为肌成纤维细胞样细胞[2]，并分泌纤连蛋白(fibronectin, FN)及Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型胶原等细胞外基质成分，参与组织修复；若PSCs活化过度则可造成细胞外基质的大量沉积，最终导致胰腺组织纤维化[3-4]。柚皮素为黄酮类化合物，在自然界中分布广泛，具有抗炎、抗氧化、免疫调节等多种生物学功能[5]。对人急性单核细胞白血病细胞系THP-1的体外研究表明，柚皮素可通过抑制NF-κB信号通路活性从而抑制多种促炎因子的产生[6]；在胆固醇诱导的大鼠肝炎模型中，使用柚皮素可显著减轻大鼠肝脏炎症反应[7]。另有多项研究表明柚皮素在缓解多种组织器官的纤维化中也发挥重要作用。在四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化模型中，柚皮素可通过抑制TGF-β/Smad3、JNK/Smad3等信号通路抑制肝星状细胞活化，从而改善肝纤维化[8]；柚皮素与积雪草酸联合应用可通过抑制TGF-β/Smad信号通路显著改善肾纤维化[9]；此外，柚皮素对肺纤维化和肺癌转移亦具有明显抑制作用[10]。然而，目前尚无关于柚皮素在胰腺纤维化中作用的相关研究报道。本研究应用CP小鼠和PSCs进行相关实验，旨在从体内和体外两个方面综合探讨柚皮素在胰腺纤维化中可能发挥的作用。

材料与方法

一、实验动物及分组

18只SPF级6周龄雄性C57BL/6小鼠购于上海灵畅生物科技有限公司，将其按数字表法随机分为对照组、CP组和柚皮素干预组(柚皮素组)，每组6只。采用腹腔注射雨蛙素的方法构建CP模型，剂量为50 μg/kg，每天6次(两次给药间隔1 h)，每周一、三、五给药，共6周；柚皮素组于造模后第4周的第1天开始予柚皮素灌胃。柚皮素用0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶解，剂量为200 mg/kg，每天1次，直至处死小鼠的前一天；对照组和CP组予等容积CMC-Na灌胃。造模期间行最后一次雨蛙素注射5 d后使用水合氯醛注射麻醉小鼠，颈椎脱臼法处死，常规剖腹取胰腺组织，置于4%多聚甲醛中固定。

二、胰腺组织病理学检查及胶原纤维沉积度检测

取各组小鼠多聚甲醛固定的胰腺组织，石蜡包埋、切片，分别行苏木精-伊红染色及针对胶原纤维的天狼星红染色，光学显微镜下观察胰腺组织的病理学变化，并参照改良Schmidt评价标准[11]进行胰腺组织病理评分：(1)炎症细胞浸润(无炎症细胞浸润为0分，炎症细胞浸润<5%、5%～<10%、10%～<50%、≥50%分别计1、2、3、4分)；(2)腺泡萎缩程度(无腺泡萎缩为0分，少量、中等量、大量或严重腺泡萎缩分别计1、2、3分)；(3)胶原纤维化程度(无纤维化为0分，局限性纤维化为2分，弥漫性纤维化为4分)。三项之和即为总分。胶原纤维沉积程度以胶原纤维阳性区域占单个视野全部区域的百分比来表示。所有数据均由随机选择各小鼠5张胰腺切片，每张胰腺切片随机选择6个视野进行观察、计算得到。

三、PSCs培养及存活率检测

人源性PSCs由美国德克萨斯大学MD安德森癌症中心Craig D Logsdon教授赠予，使用含10%胎牛血清、1%双抗和1∶20 000 De-plasma的高糖型DMEM培养液常规培养、传代。

利用高敏CCK-8法细胞增殖检测试剂盒(江苏凯基生物公司)检测细胞活性。于96孔板中加入PSCs(1×104个细胞/孔，100 μl培养液)，于恒温培养箱中培养24 h，加不同浓度(0、5、10、20、50、100、150、200 μmol/L)柚皮素进行干预，以单加DMSO的PSCs作为对照组，每组设置3个复孔，继续培养24 h，再加入CCK-8试剂，10 μl/孔，分别避光继续孵育1、2、3、4 h，上酶标仪检测450 nm处的吸光度值(A450值)，计算不同浓度柚皮素干预的细胞存活率。

四、PSCs活化、增殖与凋亡蛋白表达的检测

使用直径10 cm的培养皿培养PSCs，每个培养皿10 ml培养液，待细胞生长密度达到50%～70%时，用外源重组蛋白TGF-β1(2 ng/ml)单纯刺激PSCs(TGF-β1刺激组)，以及TGF-β1(2 ng/ml)刺激1 h后分别加低(50 μmol/L)、中(100 μmol/L)、高浓度(150 μmol/L)柚皮素干预PSCs，以单加DMSO的PSCs作为对照组。干预培养36 h后，离心收集细胞，加入适量RIPA裂解液，低温下20 min内振荡3～4次，充分裂解细胞，13 200 r/min离心15 min(离心半径10 cm)，取上清。采用BCA定量试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司)测定总蛋白浓度。常规行蛋白质免疫印迹法检测PSCs活化标志蛋白FN和Ⅰ型胶原蛋白α1链(collagen type Ⅰ alpla 1, COL1A1)、细胞增殖标志物p21以及抗凋亡蛋白Bcl-xL和促凋亡蛋白Bax、Bid的表达，以GAPDH或β-actin作为内参。抗β-actin、GAPDH抗体购自武汉Engibody Biotechnology公司；Anti-FN抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司；抗COL1A1、p21、Bcl-xL、Bax、Bid抗体均购自美国Cell Signal Technology公司；HRP标记山羊抗小鼠IgG抗体、HRP标记山羊抗兔IgG抗体购自上海雅酶生物公司。最后ECL发光，X片曝光、显影、定影。实验至少重复3次。应用Image J软件分析扫描图像，以目的条带与内参条带的灰度值比为蛋白相对表达量。

五、统计学处理

结 果

一、各组小鼠胰腺病理学改变和胶原纤维沉积程度比较

对照组小鼠胰腺组织结构完整，腺泡排列紧致，未见腺泡萎缩、腺泡导管组织转化；CP组小鼠胰腺组织出现明显腺泡萎缩、腺泡导管组织转化和炎症细胞浸润等CP特征性病理学改变；柚皮素组小鼠胰腺组织病理改变较CP组明显改善，腺泡形态恢复至较完整状态，腺泡排列更为紧致(图1)。对照组、CP组、柚皮素组小鼠胰腺组织病理评分分别为0、(7.33±1.15)、(4.67±1.15)分，CP组显著高于对照组，柚皮素组显著低于CP组，差异均有统计学意义(P值均<0.05)，提示CP模型诱导成功，而柚皮素可显著缓解CP小鼠的胰腺组织病理损伤。

图1 对照组(1A)、慢性胰腺炎组(1B)和柚皮素组(1C)小鼠胰腺组织病理改变(苏木精-伊红染色 ×100)

对照组小鼠胰腺组织未见胶原纤维沉积；CP组小鼠胰腺组织出现广泛的胶原纤维沉积；而柚皮素组小鼠胰腺组织胶原纤维沉积显著减少(图2)。对照组、CP组、柚皮素组小鼠胰腺组织胶原纤维阳性区域占比分别为(4±2)%、(46±4)%、(28±2)%，CP组显著高于对照组，柚皮素组显著低于CP组，差异均有统计学意义(P值均<0.05)，提示柚皮素可明显改善CP小鼠胰腺组织的纤维化程度。

图2 对照组(2A)、慢性胰腺炎组(2B)和柚皮素组(2C)小鼠胰腺组织胶原纤维沉积(天狼星红染色 ×100 )

二、不同浓度柚皮素干预后PSCs细胞存活率的变化

与对照组比较，5、10、20、50、100、150、200 μmol/L柚皮素干预PSCs 24 h后，仅200 μmol/L柚皮素干预组PSCs存活率降为83.0%，差异有统计学意义(P值<0.05)，而其他浓度柚皮素干预不影响PSCs存活率，故后续实验选择150 μmol/L作为柚皮素干预PSCs的最大药物浓度。

三、各组PSCs活化相关蛋白表达水平比较

对照组，TGF-β1刺激组，TGF-β1刺激后低、中、高浓度柚皮素干预组PSCs的FN蛋白表达量分别为0.02、0.76、0.67、0.34、0.07，COL1A1蛋白表达量分别为0.51、1.71、1.34、0.84、0.11，TGF-β1刺激组显著高于对照组，TGF-β1刺激后低、中、高浓度柚皮素干预组则呈浓度依赖性显著低于TGF-β1刺激组，差异均有统计学意义(P值均<0.05，图3)，提示TGF-β1刺激可促进FN及COL1A1蛋白表达，即促进PSCs的活化，而柚皮素干预可显著抑制TGF-β1诱导的FN及COL1A1蛋白表达，即抑制PSCs的活化。

注：TGF-β1为转化生长因子-β1；PSCs为胰腺星状细胞图3 对照组(1)，TGF-β1刺激组(2)，TGF-β1刺激后低(3)、中(4)、高(5)浓度柚皮素干预组PSCs活化相关蛋白的表达

四、各组PSCs增殖标志物蛋白表达水平比较

对照组，TGF-β1刺激组，TGF-β1刺激后低、中、高浓度柚皮素干预组PSCs的p21蛋白表达量分别为0.87、1.18、1.27、1.22、1.00，TGF-β1刺激组显著高于对照组，TGF-β1刺激后高浓度柚皮素干预组显著低于TGF-β1刺激组，差异均有统计学意义(P值均<0.05，图4)，而TGF-β1刺激后低、中浓度柚皮素干预组与TGF-β1刺激组差异无统计学意义(P>0.05)，提示TGF-β1刺激可促进PSCs增殖，而高浓度柚皮素可显著抑制TGF-β1诱导的PSCs增殖。

注：TGF-β1为转化生长因子-β1；PSCs为胰腺星状细胞图4 对照组(1)、TGF-β1刺激组(2)、TGF-β1刺激后低(3)、中(4)、高(5)浓度柚皮素干预组PSCs增殖相关蛋白表达

五、各组PSCs凋亡标志物蛋白表达水平比较

对照组，TGF-β1刺激组，TGF-β1刺激后低、中、高浓度柚皮素干预组Bcl-xL蛋白表达量分别为2.09、2.21、2.38、2.50、2.12，Bax蛋白表达量分别为0.98、0.88、0.98、1.00、0.88，Bid蛋白表达量分别为1.15、1.09、1.14、1.18、1.18，各组之间的差异均无统计学意义(P值均>0.05，图5)，提示TGF-β1刺激和柚皮素干预对PSCs凋亡均无明显影响。

注：TGF-β1为转化生长因子-β1；PSCs为胰腺星状细胞图5 对照组(1)、TGF-β1刺激组(2)、TGF-β1刺激后低(3)、中(4)、高(5)浓度柚皮素干预组PSCs凋亡相关蛋白表达

讨 论

在各种因素导致的胰腺急性损伤和炎症状态下，PSCs由于各种因子的刺激而活化，可分泌大量促细胞增殖和促纤维化因子，改变胰腺微环境，并分泌多种胶原纤维类蛋白和金属蛋白酶及其抑制剂等参与细胞外基质降解与重构，最终促进胰腺纤维化进程[12]。由此可见，PSCs的活化是胰腺纤维化的核心环节，因此抑制PSCs的活化是缓解胰腺纤维化的重要途径。

TGF-β1作为组织纤维化的关键性调节因子，可通过激活其下游Smad转录因子促进PSCs活化、增殖，活化的PSCs分泌大量FN和Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原等重要细胞外基质成分，参与多种组织器官纤维化进程[13-15]，故本研究中使用TGF-β1刺激PSCs活化，模拟其在胰腺纤维化中的活性改变，随后使用不同浓度的柚皮素对细胞进行干预。结果显示，柚皮素可显著改善CP小鼠胰腺组织的炎症、萎缩和纤维化程度，缓解雨蛙素所致胰腺损伤；体外细胞实验结果显示，TGF-β1可促进细胞外基质重要成分FN和COL1A1及细胞增殖标志物p21的蛋白表达，即可促进PSCs的活化和增殖，而柚皮素可显著抑制上述蛋白的表达，表明柚皮素对PSCs的活化和增殖具有抑制作用。此外，TGF-β1刺激和柚皮素处理均对PSCs的凋亡无明显影响。

柚皮素是一种具有抗肿瘤、抗衰老、调节脂肪代谢等多种生物学功能的黄酮类化合物[16]。已有体内外研究表明，柚皮素可通过FKBP4/NR3C1/NRF2信号通路抑制人乳腺癌细胞的自噬和增殖过程[17]。本研究中柚皮素对PSCs的活化和增殖过程发挥抑制作用与上述研究结果一致。结合前文所述PSCs在炎症反应、组织创伤修复以及纤维化相关生理、病理过程中的重要调控作用，笔者推测柚皮素可通过抑制PSCs活化和增殖，减少FN和I型胶原等细胞外基质重要成分的表达，从而缓解胰腺组织纤维化，对CP的胰腺纤维化可能具有潜在的治疗价值。

利益冲突所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明吕彦玮：实验操作、论文撰写；黄仁前、林曦、韩超：数据整理、统计学分析；王丽娟、胡良皞、李兆申：研究指导、论文修改、经费支持