大鼠交泰丸含药血清预处理对人脑胶质细胞氧化损伤的改善作用及其分子机制

区浩松，杨阳，赵俊云

北京中医药大学生命科学学院，北京 102488

交泰丸是临床上常用的治疗心肾不交型失眠症的中医经典方剂，以黄连、肉桂组方，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤的作用［1-2］。失眠是由于长期情绪紧张或抑郁、负性精神刺激及精神创伤等因素造成大脑皮层兴奋与抑制调节功能失调而引起的，长期失眠可导致能量消耗增加，而能量产生的过程中伴有活性氧（ROS）的形成，大脑内ROS 为主的自由基分子的增加和积累可引起氧化应激损伤［3］。以往对于交泰丸作用机制的研究大多集中在其对失眠的治疗作用方面，但关于其是否可以改善脑部细胞氧化损伤的研究较少。基于此，2021年11月—2022年2月，本研究使用大鼠交泰丸含药血清对过氧化氢（H2O2）诱导的人脑胶质细胞（HEB）氧化损伤模型进行干预，观察其对HEB 氧化损伤的改善作用，并从细胞活力、细胞凋亡、细胞氧化应激水平及衰老相关基因沉默信息调节因子1（SIRT1）、趋化因子联接因子1（CXCL1）、叉头框转录因子O 亚族1（FOXO1）、P16、白细胞介素1α（IL-1α）、胰岛素样生长因子结合蛋白3（IGFBP3）、IL-6 的表达探讨交泰丸抗脑部氧化损伤的分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料 动物：SPF级雄性SD大鼠10只，体质量（200±20）g，购自北京斯贝福生物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2015-0015。细胞：HEB 购买自苏州北纳创联生物技术有限公司。试剂：肉桂及黄连饮片购自北京同仁堂，β-半乳糖苷酶染色试剂盒、活性氧检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，CCK-8 试剂盒购自北京翱翔生物科技有限公司，2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix购自武汉赛维尔生物科技有限公司Hoechst33342荧光染料、BCA 蛋白定量试剂盒、超敏发光液购自北京索莱宝科技有限公司，总RNA 小提试剂盒购自广州美基生物科技有限公司，RevertAid FirstStrand cDNA Synthesis Kit购自美国Thermo Fisher Scientific。仪器：二氧化碳培养箱购自日本Sanyo，超微量分光光度计购自美国Pultton，QuantStudioTM6 Flex Real-Time PCR System 购自美国 Thermo Fisher Scientific，共聚焦显微镜购自日本Olympus，流式细胞仪购自美国Beckman，正倒置一体显微镜购自美国Echo，酶标仪购自德国BioTek。

1.2 交泰丸含药血清制备 将SD 大鼠在正常环境、光照及饮食下进行适应性训练，1 周后开始实验。将大鼠随机分为两部分各5 只，分别制备含药血清及空白血清。含药血清：大鼠给予肉桂和黄连（1∶9）水提物灌胃，生药含量为0.31 g/mL，灌服量为 1 次/天，每次 2 mL，连续灌服 5 d。第5 天时，大鼠禁食不禁水，在最后一次灌胃4 h 后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，从腹主动脉取血，3 000 r/min 离心10 min 提取血清，过滤除菌，56 ℃补液灭活30 min，分装后在-20 ℃保存。空白血清：大鼠给予同体积蒸馏水灌胃，其他操作方法同上。将DMEM培养基与血清配制成10%完全培养基，待用。

1.3 细胞分组处理及氧化损伤模型的建立 将HEB 以 4×104/孔接种到 96 孔板，培养 12 h 后分为对照组、模型组及交泰丸组，每组设6个复孔。对照组及模型组加入空白血清培养基，交泰丸组加入含药血清培养基。培养24 h 后，交泰丸组及模型组使用终浓度为10 μmol/L的H2O2处理建立HEB氧化损伤模型，对照组使用等体积PBS 处理。处理1 h 后，各组更换培养液，继续培养24 h。

1.4 细胞氧化损伤比例观察 三组细胞培养24 h后吸出培养液，用PBS 洗1 次，用染色固定液在室温下固定 15 h。PBS 洗涤 3 次，将 500 μL β-半乳糖苷酶染色工作液加入孔内，37 ℃孵育过夜。显微镜下每孔随机取三个细胞密度大致相同的视野，按照（视野内阳性细胞数/视野内总细胞数）×100%计算阳性细胞比例，阳性细胞比例即为氧化损伤比例。

1.5 细胞活力观察 采用CCK-8 法。三组细胞培养 24 h 后吸出培养液，取 100 μL CCK-8 工作液加入各孔内，2 h 后用酶标仪检测各孔在450 nm 时的光密度值（OD），以（交泰丸组OD－模型组OD/对照组OD-模型组OD）×100%计算细胞活力。

1.6 细胞凋亡情况观察 将三组细胞消化、离心后弃去上清液，加入终浓度为5 μg/mL的Hoechst33342荧光染料和终浓度10 μg/mL的PI染色液，在37 ℃孵育20 min。离心后弃去上清液，PBS 重悬，避光。上流式细胞仪检测细胞凋亡率，设第一通道的激发波长为405 nm、检测波长为450 nm，设第二通道的激发波长为488 nm、检测波长为610 nm。

1.7 细胞氧化应激水平观察 采用活性氧荧光染色法。三组细胞培养24 h 后吸出培养液，加入终浓度为5 μg/mL 的Hoechst33342 荧光染料和终浓度1 μmol/L的DCFH-DA荧光染料，在37 ℃孵育20 min，使用DMEM 培养基轻轻洗3 次后加入PBS。在激光共聚焦显微镜下观察细胞内活性氧（ROS）水平，设第一组通道激发波长为405 nm、检测波长为430～470 nm，设第二组通道激发波长为488 nm、检测波长为500～600 nm。

1.8 细 胞 SIRT1、CXCL1、FOXO1、P16、IL-1α、IGFBP3、IL-6 mRNA 表达检测 采用 qRT-PCR 法。三组细胞培养24 h 后吸出培养液，严格按照总RNA小提试剂盒操作方法提取细胞总RNA，使用反转录试剂盒反转录合成cDNA，反转录条件：42 ℃60 min，70 ℃5 min。使用实时荧光定量PCR 仪进行扩增，SIRT1、CXCL1、FOXO1、P16、IL-1α、IGFBP3、IL-6及内参GAPDH 的引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司设计合成，引物序列见表1。PCR 扩增条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40 个循环，运行机器自身的熔解曲线。采用2－ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。

表1 SIRT1、CXCL1、FOXO1、P16、IL-1α、IGFBP3、IL-6及GAPDH引物序列

1.9 统计学方法 采用SPSS20.0 统计软件。计量资料采用Kolmogorov-Smirnov检验和Shapiro-Wilk检验进行正态性检验，若呈正态分布以表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用LSD-t检验，重复测量数据采用重复测量的方差分析；若呈非正态分布以M（P25，P75）表示，组间比较采用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组细胞氧化损伤比例比较 β-半乳糖苷酶染色结果显示，对照组、模型组、交泰丸组细胞氧化损 伤 比例 分 别 为 12.78% ± 2.24%、32.60% ±8.55%、17.08% ± 2.84%，模型组＞交泰丸组＞对照组（P均＜0.05）。见OSID码图1。

2.2 三组细胞活力比较 对照组、模型组、交泰丸组细胞活力分别为 99.44% ± 4.84%、49.75% ±1.62%、54.36% ± 2.47%，对照组＞交泰丸组＞模型组（P均＜0.05）。

2.3 三组细胞凋亡情况比较 对照组、模型组、交泰丸组细胞凋亡率分别5.64% ± 4.44%、59.37% ±1.70%、41.6%±1.08%，模型组＞交泰丸组＞对照组（P均＜0.05）。见OSID码图2。

2.4 三组细胞氧化应激水平比较 激光共聚焦显微镜下可见，对照组细胞生长良好，轮廓完整，核膜边界清晰，ROS荧光强度低；模型组细胞形态有明显变化，细胞膜边缘轮廓不清晰，核膜发生部分裂解，ROS荧光强度增强；交泰丸组细胞膜及核膜结构较模型组更加完整，ROS荧光强度降低。见OSID码图3。

2.5 三组细胞SIRT1、CXCL1、FOXO1、P16、IL-1α、IGFBP3、IL-6 mRNA表达比较 见表2。

表2 三组细胞SIRT1、CXCL1、FOXO1、P16、IL-1α、IGFBP3、IL-6 mRNA表达比较（）

表2 三组细胞SIRT1、CXCL1、FOXO1、P16、IL-1α、IGFBP3、IL-6 mRNA表达比较（）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

组别对照组模型组交泰丸组IL-6 mRNA 1.01±0.14 1.01±0.22 1.08±0.47 SIRT1 mRNA 1.00±0.04 0.43±0.04*0.96±0.05#CXCL1 mRNA 1.00±0.00 1.75±0.00*0.86±0.18 FOXO1 mRNA 0.98±0.08 0.74±0.03*1.00±0.04#P16 mRNA 1.03±0.31 1.02±0.26 1.04±0.35 IL-1α mRNA 1.05±0.33 1.01±0.18 1.02±0.26 IGFBP3 mRNA 1.00±0.02 1.05±0.40 1.03±0.30

3 讨论

中医认为，心肾不交型失眠主要以心肾不交为主轴，心火不降，肾水不升，形成未济现象，阴阳失交而发为失眠［4］。交泰丸以黄连、肉桂组方，黄连性寒、味苦，有清热燥湿、泻火解毒之功效，具有抗炎、抗氧化、保护神经的作用［5］；肉桂性大热、味辛甘，有补火助阳、散寒止痛、温经通脉之功效，具有神经保护、降脂、抗氧化、抗炎的作用［6］。两药配伍体现了中医交通心肾、引火归元的治则。

本研究使用终浓度为10 μmol/L 的H2O2处理HEB 细胞建立了细胞氧化损伤模型，并使用交泰丸含药血清培养基预处理，结果显示交泰丸含药血清降低了细胞氧化损伤比例，提示交泰丸含药血清处理能有效抵抗H2O2诱导的HEB 细胞氧化损伤。本研究结果同时显示，交泰丸含药血清预处理的HEB细胞活力增强、ROS荧光强度减弱、凋亡细胞比例降低，提示交泰丸含药血清可促进H2O2处理的细胞活力恢复、降低细胞内氧化损伤水平，并可能通过抗凋亡途径抵抗细胞氧化损伤。

氧化损伤和炎症是导致衰老的重要因素，SIRT1、FOXO1 可共同调节氧化损伤和炎症，从而参与衰老的调控［7］。FOXO1是Forkhead转录因子家族的O亚类成员之一，也被称为长寿因子，广泛存在于生物体中，在转录中具有关键的调节作用。核激活的FOXO1可通过控制下游基因的表达，与靶点结合参与抗氧化应激、细胞存活、凋亡、自噬、代谢调节等生物过程［8］。SIRT1是NAD+依赖性脱乙酰酶家族的成员，是重要的长寿基因。SIRT1参与DNA修复、凋亡、炎症、衰老等生物过程，FOXO1 可受SIRT1 调控激活细胞自噬，参与细胞增殖等过程，对衰老、氧化应激等有着重要作用［9］。本研究结果显示，交泰丸组SIRT1、FOXO1 mRNA 表达水平显著上升，提示交泰丸可能通过调控细胞自噬、增殖等途径发挥抗细胞氧化损伤与抗衰老的作用。本研究选取的CXCL1、IL-1α、IL-6、P16、IGFBP3 均是衰老相关基因。CXCL1 是CXC 趋化因子重要的家族成员，参与许多炎症性疾病发展，也是一种有效的中性粒细胞趋化因子和激活剂，主要通过CXCR2 受体起作用［10］。IL-1α 与 IL-6 均是促炎因子，IL-6 受 IL-1α 调控，参与细胞衰老，与衰老诱导的炎症密切相关［11-12］。本研究结果显示，模型组 CXCL1 mRNA 表达较对照组上升，交泰丸组CXCL1 mRNA 表达较模型组下调，提示交泰丸可能通过抗炎症途径减少炎性细胞衰老的发生。本研究同时发现，IL-1α、IL-6、IGFBP3、P16的mRNA 表达无差异，后续我们将设计不同时间和剂量等梯度深入探讨可能的分子水平变化。

综上所述，本研究基于交泰丸交通心肾、引火归元的理论，通过大鼠交泰丸含药血清干预HEB 氧化损伤模型，发现交泰丸含药血清可抑制H2O2诱导的HEB氧化损伤，其可能通过增强细胞活力、抗细胞凋亡、降低胞内ROS 水平以及抗炎发挥作用。本研究只是初步探讨了交泰丸对脑部氧化损伤的改善作用及其机制，后续还将结合体内研究进一步深入探究交泰丸抗脑部氧化损伤分子机制，为中医心肾理论的生物学阐释提供实验依据。