固相萃取—高效液相色谱质谱法对环境水样中沙星类化合物的分析

成晓叶，牛 禾，冀雅茹，陈 怡，魏文婉，陈 昊，余彬彬

（1.台州学院医药化工与材料工程学院，浙江 台州 318000；2.浙江省台州生态环境监测中心，浙江 台州 318000）

0 引言

沙星类化合物是一类重要而成功的合成抗生素，广泛应用于人类、畜牧业和水产养殖，具有抗菌谱广、口服吸收好、成本低等优点。 沙星类化合物主要指喹诺酮类化合物或喹诺酮类抗生素，其作用于细菌DNA，抑制拓扑异构酶，具有强而快速的抗菌作用。由于喹诺酮类药物被广泛用于治疗各种疾病，这就使得沙星类化合物被排泄到自然环境中，导致全球公共卫生威胁日益增加。据报道，沙星类化合物主要存在于医院污水处理物、污水处理厂、河流甚至饮用水中[1]。

随着大量沙星类化合药物的使用，水产品体内也有沙星类药物及其代谢产物的残留，并随着水产品的代谢产物排入水环境中[2]。而其在水环境中的存在有可能改变水环境中微生物的结构，即使是微量化合物的存在也可导致环境中细菌抗药性的增强、抗病菌种的出现及人畜交叉耐药性等[3]，即生态系统抗菌素的耐药性不断增加。 这不仅可能对生态环境造成威胁，也可能沿着食物链对人体健康产生威胁。因此，需加强对环境水体中残留沙星类化合物及其质量浓度的监督检测。

目前，对沙星类化合物的主要检测方法包括：免疫分析法[4-5]、 毛细管电泳法[6]、 高效液相色谱法（HPLC）[7]和液相色谱-质谱联用法[8-10]等。 其中液相色谱-串联质谱法因其灵敏度更高、 特异性更强、可更好定量和确证[11]等优点而得到广泛应用。 但环境样品一般基质较为复杂，故容易影响检测并导致仪器污染。此外，样品中极低浓度的喹诺酮类药物对检测灵敏度要求也更高。因此，选择合适的前处理方法尤为重要，固相萃取前处理技术因所用的溶剂量少且富集效果好[12-13]，与高效液相色谱质谱法搭配较为简单且灵敏度更高受到广泛应用[14]。 通过采用固相萃取—高效液相色谱质谱法并重点优化固相萃取条件，为环境水体中沙星类化合物的检测分析提供优化依据。

1 试验过程

1.1 主要仪器和试剂

主要仪器：液相色谱质谱仪（LC-3000 (Thermo ultimate)-Q trap 5500 (AB)） 配Kinetex R 2.6 μm F5 100（50 mm×3.0 mm）色谱柱（W-SPE12 手动固相萃取装置(北京莱伯泰科仪器股份有限公司)）；QSC-12T 氮吹仪 (上海精密仪器仪表有限公司)；25，50，100 μL 微量进样针(hamilton)； 超声波清洗机；pH 计；电子分析天平；药用一次性注射器(1 mL)；SCAA-114 0.22 μm 针式滤器；C18 固相萃取柱（0.5 g/3 mL）、硅胶固相萃取柱(1.0 g/3 mL，自填)、C3N4固相萃取柱(0.3 g/3 mL，C3N4材料：在温度为550 ℃条件下煅烧三聚氰胺2 h 后研磨得到C3N4)，Poly-sery HLB 固相萃取柱（规格为0.5 g/3 mL）。

主要药品和试剂：甲醇(TEDIA，色谱纯)，乙腈（TEDIA，色谱纯），盐酸，氨水，EDTA（乙二胺四乙酸，分析纯），超纯水，甲酸，三聚氰胺(分析纯)；18 种沙星类化合物标准品 （质量浓度为100 μg/mL）：西咪替丁（CIM）、雷尼替丁（RN）、环丙沙星（CIP）、克林沙星（CLX）、恩诺沙星（ENO）、氟甲喹（UB）、洛美沙星（LOM）、诺氟沙星（NOR）、氧氟沙星（OFL）、沙拉沙星（SAR）、恶喹酸（OA）、培氟沙星（PEF）、依诺沙星（ENO）、萘啶酸（NA）、西诺沙星（CINX）、二氟沙星（DFX）、奥比沙星（ORB）、司帕沙星（SPA）（购自A ChemTek Inc）。

1.2 样品预处理

量取50 mL 样品并用氨水调节pH 值为10，在水样中加入27.2 mg 的EDTA 后超声混合溶解。

样品加标： 向上述处理后的样品中加入一定浓度的沙星类化合物的混合标样。

1.3 固相萃取步骤

先用3 mL 甲醇活化SPE 小柱，再加入3 mL pH值为7 的纯水进行平衡后进行上样，上样结束后用洗耳球将SPE 小柱吹干，再用3 mL（V（甲醇）∶V（乙腈）=1 ∶1）进行洗脱，将洗脱下来的液体于40 ℃氮气下吹干后用200 μL 溶剂（V(甲醇）∶V（纯水）=2 ∶8）进行复溶，定容至500 μL，用1 mL 一次性注射器吸取溶液,经过0.22 μm 针式滤器过滤，供LC-MS/MS 分析测试。

1.4 液相色谱条件

流动相：A 为体积分数为0.1%的甲酸乙腈溶液，B 为体积分数为0.1%的甲酸水溶液，流速为0.4 mL/min；梯度洗脱：0～1 min，体积分数为3%B；1～11 min，体积分数为3%～75%B；11 ～21 min，体积分数为75%～95%B；21～25 min，体积分数为95%～3%B；25～28 min，体积分数为3%B；柱温为35 ℃；进样量为10 μL。

1.5 质谱分析条件

质谱条件：采用电喷雾电离源(ESI)，正离子模式离子喷雾电压(IS)为5 500 V，辅助气压力(GS2)为413 kPa，雾化器压力(GS1)为345 kPa，雾化温度(TEM)为500 ℃，射入电压(EP)为10 V，气帘气(CUR)压力为207 kPa。

2 结果讨论与分析

2.1 质谱条件优化和工作曲线

采用ESI 离子源模式、正离子分析条件对18 种沙星类化合物进行分析，分析结果见表1。 18 种沙星类化合物定量离子流色谱图像见图1。 标准曲线用质量浓度分别为2.5，5.0，10.0，15.0，20.0 μg/L 的标准溶液配制，结果见表2。

表1 18 种目标沙星类化合物质谱优化参数

表2 18 种沙星类化合物工作曲线

图1 18 种沙星类化合物定量离子流色谱图像

2.2 样品提取pH 值条件的优化

样品溶液中的pH 值影响着沙星类化合物的存在形式，即溶液中沙星类化合物的离子状态或分子状态对固相萃取效率有很大的影响。 有研究[8]表明，沙星类化合物因其特有的羧基，当采用萃取方式进行样品前处理和萃取液的pH 值调至碱性条件时，沙星类化合物易呈离子态，可显著提高沙星类化合物在萃取层溶液中的分配系数，从而保证较高的回收率。另有研究证明，碱性条件下沙星类化合物的提取效率更高[15]。 综上所述，实验前优化处理选择用氨水将样品pH 值调节至10，再进行固相萃取。

2.3 不同固相萃取小柱的影响

4 种不同固相萃取柱中3 种为商品化的固相萃取柱，另一种为自行制备的C3N4材料，考虑C3N4具有高吸附性能表面比及其在吸附领域的广泛应用，试验采用C3N4材料为吸附剂。测试结果见表3。由表3 可知，C18 固相萃取小柱的平均回收率为2.7%～111.2%，相对平均偏差为0.8%～50.0%；硅胶固相萃取小柱平均回收率为0.2%～92.1%，相对平均偏差为0.1%～74.0%；C3N4固相萃取小柱平均回收率为1.0%～122.5%，相对平均偏差为0.2%～14.6%；HLB固相萃取小柱平均回收率为31.9%～134.2%，相对平均偏差为0.8%～46.5%。 综上所述，HLB 固相小柱对于18 种沙星类化合物，显示了较好的萃取性能，适合作为批量样品的检测研究。 但C3N4则显示了较好的稳定性，其相对平均偏差最小，而且彰显了对沙星类化合物的选择吸附功能，部分沙星类化合物在C3N4固相萃取柱上被稳定吸附，如依诺沙星、培氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星等在C3N4固相萃取柱上较少出现回收率偏大或偏小的情况。

表3 不同种固相萃取小柱下18 种沙星类化合物的回收率 %

2.4 方法检出限的计算

按照1.2 和1.3 节的方法采用HLB 固相萃取柱进行处理，样品平行测定7 次计算标准偏差S，根据MDL=S×t/v （在99% 置信区间，t6= 3.143，v = 50 mL）计算方法检出限，具体结果见表4。

表4 18 种沙星类化合物的检出限 μg·L-1

2.5 实际水样测试结果

按照上述优化的方法对4 个实际饮用水水样进行沙星类化合物的测定，在水样1 中检测出质量浓度分别为19.19，9.11 和6.05 ng/L 的西咪替丁（CIM）、沙拉沙星（SAR）和二氧沙星（DFX），其沙星类化合物总质量浓度为34.35 ng/L；在水样2 中检测出质量浓度为6.73 ng/L 的恩诺沙星（ENR），其沙星类化合物总质量浓度为6.73 ng/L；在水样3 和水样4 中未检到18 种沙星类化合物。 由此可见，在饮用水中检测出18 种沙星类化合物的质量浓度为0 ～19.19 ng/L。

3 结论

（1）基于固相萃取和高效液相色谱串联质谱法建立水样中18 种沙星类化合物的检测方法。结果表明，该方法有较好的方法检出限，为0.005 3～0.078 2 μg/L，加标回收率为31.9%～134.2%。

（2）根据优化固相萃取柱的各项条件和实验的酸度，比较不同固相萃取填料对方法的影响。试验表明，HLB 小柱显示了较为宽广的应用范围为31.9%～134.2%，相对平均偏差为0.8%～46.5%，可满足环境样品中18 种抗生素类化合物的痕量检测要求。同时对自制的C3N4固相萃取小柱也进行了研究，显示此填料对部分抗生素有更好的稳定性，后期将进一步开展C3N4在固相萃取方面的应用。

（3）该方法准确、灵敏，可满足饮用水中多种沙星类化合物的分析需要。 对4 个饮用水源地水样中沙星类化合物的检测质量浓度为0～19.19 ng/L。