应用MALDI-TOF-MS快速鉴定从鸡胴体中分离的一株空肠弯曲菌

吴福平， 朱宏锴， 陈 莹， 吴瑜凡， 邵景东

1.张家港检验认证有限公司，张家港 215600；

2.华东理工大学分析测试中心 200237；

3.张家港海关综合技术中心，张家港 215600

空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni，C．jejuni）是主要食源性病原菌之一，可引起人及动物多种疾病，主要症状为腹泻性肠炎［1-3］。

目前，在空肠弯曲菌检测鉴定中，实验室主要采用传统生化鉴定和分子生物学鉴定方法。传统生化鉴定方法主要包含革兰氏染色镜检，动力观察，25℃微需氧、42℃有氧生长试验，马尿酸盐、吲哚乙酸酯水解等试验，有条件的实验室或使用全自动微生物鉴定系统来进行鉴定，鉴定周期较长，操作相对繁琐，同时鉴定结果也受培养基、试剂质量、培养条件、生长状态等外部因素影响。近年来，随着分子生物学技术的发展，荧光定量PCR、16S rRNA基因测序技术、多重PCR法等技术也越来越多的应用于空肠弯曲菌的检测，有效填充了空肠弯曲菌的快速检测鉴定技术空白［4-6］。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrixassisted laser desorption／ionization time of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）主要以细菌表面蛋白为检测对象，依据数据库中标准蛋白指纹图谱与待测样品的指纹图谱分析比对，从而实现微生物的快速鉴定。本文对从鸡胴体中分离到的一株病原菌，通过MALDI-TOF-MS技术将其快速鉴定。

1 材料与方法

1.1 试剂与设备

标准菌株：空肠弯曲菌Campylobacter jejuni NCTC11168；Bolton肉汤、mCCDA琼脂、Skirrow血琼脂平板、哥伦比亚血琼脂平板，购自北京陆桥技术股份有限公司；α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）、BTS标准品，购自德国Bruker公司；VITEK2 NH鉴定卡，购自法国生物梅里埃公司；乙腈，无水乙醇，甲酸，三氟乙酸（TFA）。

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪（Microflex），德国Bruker公司生产；全自动微生物鉴定系统VITEK2 Compact，法国生物梅里埃公司生产；微生物实验室常规灭菌及培养设备，微需氧培养装置：提供微需氧条件（5%氧气、10%二氧化碳和85%氮气）。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离与纯化

参照GB 4789.9-2014《食品安全国家标准食品微生物学检验空肠弯曲菌检验》［7］操作。

1.2.2 弯曲菌属的鉴定，挑取可疑菌落进行革兰氏染色镜检，动力观察，氧化酶试验，25℃微需氧生长试验，42℃有氧生长试验。

1.2.3 空肠弯曲菌的鉴定，将符合上述弯曲菌属反应的细菌进行过氧化氢酶试验，马尿酸盐水解试验，吲哚乙酸酯水解试验。同时使用VITEK2 NH鉴定卡，麦氏浓度调节至2.70～3.30之间，通过VITEK2 compact全自动微生物鉴定系统进行生化鉴定。

1.3 MALDI-TOF MS鉴定

1.3.1 溶液配制

溶剂I：按水∶乙腈∶三氟乙酸为47.5∶50∶2.5（v／v）的比例配制，现配现用；BTS标准溶液的配制：用50μL溶剂I溶解BTS标准品。用移液器反复吹吸溶解BTS粉末，室温放置5 min，再次溶解，待BTS全部溶解后，瞬时离心，用200μL PCR管进行分装，每管5μL，-20℃保存备用；

CHCA基质溶液的配制：在CHCA粉末中加入溶剂I，使CHCA终浓度为10 mg／mL。振荡混匀，直至溶液澄清。用1.5 mL离心管进行分装，每管50 μL，用封口膜密封管口，室温放置备用。

1.3.2 样品前处理

采用甲酸提取法前处理，在EP管中加入300 μL去离子水，挑取单个菌落，混匀后加入900μL无水乙醇，13 000 r／min离心2 min，吸弃上清，必要时可再次离心，以便去除乙醇；室温干燥3～4 min，沉淀中加入30μL 70%甲酸溶液，混匀，加入30μL乙腈13 000 r／min离心2 min；吸取1μL上清至靶盘点样，待晾干以后，立即覆盖1μL基质溶液，干燥以后上机。

1.3.3 数据采集分析与判定

用标准品对仪器校准后，应用FlexControl、Bio-Typer软件对样品图谱信息采集和分析。以待检样品与数据库中标准菌株谱图的符合度为判断标准，分值越高表示鉴定准确性的可信度越高。分值在2.300～3.000之间，可完全确认鉴定结果；2.000～2.299，可基本确认鉴定结果；1.700～1.999，为不确定结果；0.000-1.699，表示鉴定结果不可信。

1.3.4 MALDI-TOF-MS空肠弯曲菌数据库补充

运用MALDI-TOF-MS对空肠弯曲菌标准菌株NCTC11168进行图谱数据采集，并将有效谱图添加至鉴定数据库。

2 结果

2.1 细菌传统生化鉴定

观察菌落形态特征，mCCD平板，淡灰色菌落，有金属光泽，扁平；Skirrow血琼脂平板，灰色扁平菌落，湿润有光泽。镜检为革兰氏阴性菌，菌体弯曲如小逗点；动力观察呈现螺旋状运动；氧化酶试验阳性，25℃微需氧、42℃有氧生长试验均未生长；过氧化氢酶试验阳性；马尿酸盐水解试验阳性；吲哚乙酸酯水解试验阳性。

2.2 VITEK2 NH鉴定

根据全自动微生物鉴定系统NH卡生化反应结果，该分离菌株鉴定为空肠弯曲菌。

2.3 MALDI-TOF-MS检测

通过检测及软件分析，以检测到的离子峰强度（intens）为纵坐标，离子质荷比（m／z）为横坐标，获得的分离菌蛋白指纹图谱具体如图1所示。与Bruker数据库比对，分离菌被鉴定为空肠弯曲菌，匹配分值为2.208，可基本确认鉴定结果。

2.4 MALDI-TOF-MS空肠弯曲菌数据库补充

本次试验共采集24张空肠弯曲菌NCTC11168有效谱图（见图2），并将谱图添加到细菌鉴定数据库中。

图2 24张空肠弯曲菌NCTC11168有效谱图谱叠加结果

2.5 MALDI-TOF-MS数据库补充后验证

经数据库补充后，分离菌株鉴定为空肠弯曲菌，匹配分值由2.208提升至2.538，完全确认菌株鉴定结果。经数据库补充后，有效提高了MALDITOF-MS在鉴定空肠弯曲菌的可信度。

3 讨论

MALDI-TOF-MS作为一种新型快速鉴定技术，在临床和疾控系统病原微生物的检测得到了广泛应用［8-14］。该技术针对细菌蛋白特征图谱进行鉴定，具备良好的稳定性和重复性，受培养基、培养时间以及其他培养条件等外部因素的影响较小［15］，可快速鉴别区分不同微生物。本文通过MALDI-TOF-MS技术将鸡胴体中分离到的一株病原菌进行快速鉴定，结果显示，MALDI-TOF-MS法鉴定结果与传统法一致，鉴定为空肠弯曲菌，且可信度较高。

MALDI-TOF-MS数据库中标准蛋白指纹图谱完整、准确性决定了该项鉴定技术的准确率，数据库中标准菌株的数量和种类越丰富、蛋白指纹图谱越完善，所鉴定的结果越准确。此文通过对NCTC11168空肠弯曲菌24张有效图谱数据库补充后，野生菌株鉴定的分值由2.208提升至2.538，由可基本确认提升为可完全确认鉴定结果。数据库补充后，有效提高了MALDI-TOF-MS菌株鉴定的可信度。

在检测时间上，从获得纯菌落到出鉴定结果，MALDI-TOF-MS法整个过程大约需要30 min，上机后仅需约30 s即可实现对1株待测菌的有效鉴定。成本方面仅需少量基质，靶块清洗后可重复使用，耗材使用成本低，同时1块靶块1次可实现384株待测样品的高通量检测。MALDI-TOF-MS技术在空肠弯曲菌检测鉴定方面可部分替代传统生化鉴定和分子生物学鉴别方法，可以广泛应用于微生物实验室的日常检验中，尤其适用于医院的临床样本及食物中毒样本快速诊断鉴定检测。

综上所述，MALDI-TOF-MS作为新型快速检测技术在检测空肠弯曲菌具备快速、准确、高通量、低成本等检测优势，可用于食品中空肠弯曲菌的快速筛检，也为其它食源性致病菌快速鉴定方法的建立提供参考。