麦麸发酵条件的优化及其多酚提取物的抗氧化活性研究

曹畅达， 方一铭， 黄 兴， 陶宏兵， 邓小锋， 谢小保， 赵国邦*

1.广东省科学院微生物研究所华南应用微生物国家重点实验室，广东广州 510070；

2.广东迪美新材料科技有限公司，广东肇庆526238；3.南顺香港集团，香港 999077

麦麸（小麦麸皮）是小麦加工制成面粉过程中的主要副产品，约占小麦种子质量的22%［1］。麦麸除了含有丰富的蛋白质、膳食纤维、维生素等营养物，其中还存在多糖、酚酸等具有独特生理活性的物质［2］。作为产粮大国，我国的小麦年产量已经超过了1.1亿吨，每年产生超过2000万吨的麦麸。然而由于粗纤维含量大、口感差，加之我国农产品深加工水平不高，大部分麦麸仅被制成畜牧饲料［1-3］，甚至作为垃圾处理。因此，找寻麦麸合理的深加工方法并开发高附加值的产品，具有重要的经济价值和社会意义。

许多研究已证实麦麸中的酚酸类物质具有抗氧化、抗癌等多种功效［4-5］。阿魏酸是麦麸中酚酸类物质的主要成分，一项研究发现阿魏酸可以占到麸皮干重的0.66%［6］。酚酸的存在形式有游离型，结合型和束缚型，其中绝大多数是束缚型酚酸，以醚键、酯键和糖苷键与植物细胞壁中多糖、木质素等大分子相连，属于不可溶性酚类物质［7］。研究发现通过微生物发酵的方法能够破坏细胞壁，释放束缚性酚酸，增加麦麸中游离酚酸，任雪荣［8］等发现微生物发酵后不仅提高了麦麸的水溶性酚类物质含量，还增强了抗氧化能力。使用微生物发酵的方法也符合绿色低碳的发展理念。

本研究以麦麸为原料，以阿魏酸含量为评价指标，对利用微生物发酵麦麸的工艺进行优化，并通过还原力检测试验和自由基清除试验，分析麦麸发酵产物的抗氧化能力，为麦麸的深度加工及其在制药、化妆品等领域的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

麦麸：购自市场；泡盛曲霉（Aspergillus awamori CGMCC 3.2576）、黑曲霉（Aspergillus niger，ATCC 16404）、米曲霉（Aspergillus oryzae，ATCC 56747）：广东省微生物菌种保藏中心；PDA培养基：青岛高科园海博生物技术有限公司；硫酸铵、硫酸铜、氯化钠、硫酸亚铁、氢氧化钠、盐酸、铁氰化钾、氯化铁：广州化学试剂厂；过氧化氢、甲醇、乙醇、冰醋酸、邻苯三酚：天津市富宇精细化工有限公司；阿魏酸（色谱纯）：阿拉丁；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、维生素C：国药集团化学试剂有限公司；Tris-HCl、磷酸盐缓冲液、三氯乙酸：赛默飞。

1.2 仪器与设备

TG16-WS高速离心机：上海恒科仪器有限公司；LC-20A高效液相色谱仪：岛津公司（日本）；WBK-6A恒温水浴锅、SHP-250生化培养箱：广州环凯生物科技有限公司；Re-501旋转蒸发仪：郑州宏朗仪器设备有限公司；DHG-9076A电热鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；Biosafer-10A台式冻干机：南京赛飞生物科技有限公司；UV1901紫外分光光度计：上海奥析科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 麦麸发酵

用100目筛筛去麦麸中的面粉组分，50℃烘干至恒重，粉碎；每个250 mL锥形瓶加入5 g粉碎的麦麸、0.04 g（NH4）2SO4、0.023 g CuSO4以及9 mL、19 mL或29 mL水，作为发酵培养基，121℃灭菌20 min。

三种曲霉保存在PDA斜面培养基上，向斜面培养基中加入无菌水，用接种环轻刮培养基表面，制得孢子悬液。每个锥形瓶加入1 mL孢子悬液，置于恒温培养箱中发酵培养。发酵结束后50℃烘干。

1.3.2 正交试验设计

选择发酵菌种、培养基固液比、发酵温度、发酵时间四个因素结合进行正交试验，每个因素有三个水平，采用L9（34）正交表，各因素水平见表1。

表1 正交试验各因素取值

1.3.3 游离多酚和结合型多酚的提取

1.3.3.1 游离多酚的提取

烘干的发酵麦麸以及未发酵的麦麸粉碎后以料液比1∶5的比例加入80 wt%的甲醇溶液，室温浸泡1 h，每份样品浸提两次。粗提液12 000 g离心10 min，收集上清液，40℃下用旋转蒸发仪浓缩至干燥，而后再冻干备用。

1.3.3.2 结合型多酚的提取

烘干甲醇提取后的麦麸残渣，1 g残渣加40 mL 2M NaOH溶液室温处理6 h，提取液中和至中性后，12 000 g离心10 min，收集上清液，40℃下用旋转蒸发仪浓缩至干燥，而后再冻干备用。

1.3.4 麦麸提取多酚中阿魏酸含量的检测［9］

采用高效液相色谱（HPLC）法检测两种多酚提取物中的阿魏酸。游离多酚和结合型多酚的阿魏酸之和为麦麸中总的阿魏酸含量。色谱柱Aglient TC C18柱（250×4.6 mm，5μm）；流动相：甲醇-2%醋酸（68∶32 V／V），流速1 mL／min；检测器：二极管阵列检测器；检测波长为320 nm。

1.3.5 体外抗氧化检测

1.3.5.1 超氧阴离子自由基清除试验

将1.3.3.1发酵麦麸的多酚提取物溶于水，配制阿魏酸浓度为5μg／mL、10μg／mL、15μg／mL、20 μg／mL、25μg／mL和30μg／mL的待测溶液。试管中加入2 900μL的pH＝7的Tris-HCl缓冲液和50 μL的待测液，再加入50μL的60 mM的邻苯三酚溶液（溶于0.01 M的盐酸），迅速混匀，记录反应开始后30 s和300 s在325 nm的吸光值，计算ΔA（A300s—A30s）。以等量的Tris-HCl缓冲液做对照同法测得ΔA0。超氧阴离子自由基清除率计算公式：（ΔA0—ΔA）／ΔA0×100%。

1.3.5.2 DPPH自由基清除试验［10］

将1.3.3.1发酵麦麸的多酚提取物溶于水，配制阿魏酸浓度为5μg／mL、10μg／mL、15μg／mL、20 μg／mL、25μg／mL和30μg／mL的待测溶液。DPPH溶于80%的甲醇（100μM），黑暗中搅拌16 h，调节OD515＝0.70±0.05，制成DPPH工作液。准确吸取100μL的待测溶液加入到3.9 mL的DPPH工作液中，黑暗中22℃反应2 h，测定反应液的OD515记为Ax，超纯水作为空白对照（A0）。自由基清除率的计算公式为：（A0—Ax）／A0×100%。

1.3.5.3 羟基自由基清除试验［11］

将1.3.3.1发酵麦麸的多酚提取物溶于水，配制阿魏酸浓度为5μg／mL、10μg／mL、15μg／mL、20 μg／mL、25μg／mL和30μg／mL的待测溶液。在试管中依次加入0.5 mL待测液，0.5 mL的9 mM水杨酸-乙醇溶液，0.5 mL的9 mM FeSO4，0.5 mL的8.8 mM过氧化氢，混匀，室温反应30 min。反应液在510 nm检测吸光值（Ax），超纯水做对照（A0），羟基自由基清除率计算公式：（A0—Ax）／A0×100%。

1.3.5.4 还原力检测试验［12］

将1.3.3.1发酵麦麸的多酚提取物溶于水，配制阿魏酸浓度为5μg／mL、10μg／mL、15μg／mL、20 μg／mL、25μg／mL和30μg／mL的待测溶液。1 mL的待测液与1 mL的0.2 M磷酸盐缓冲液（pH＝6.6）以及1 mL的1%铁氰化钾溶液混合，50℃水浴20 min，再加入1 mL的10 wt%三氯乙酸溶液。5000 g离心15 min，取2.5 mL混合液加入0.15 mL 0.1 wt%的FeCl3，0.2 mg／mL的维生素C作为阳性对照。在700 nm处检测吸光值，吸光值越高说明还原力越强。

2 结果和讨论

2.1 不同发酵条件下发酵麦麸中游离阿魏酸的含量

为优化麦麸发酵工艺，选择菌种、固液比、温度和时间，进行四因子三水平正交试验，通过HPLC检测发酵后麦麸中游离阿魏酸的含量作为评价指标，结果见表2。

图1可见，CMV4000探测器的非均匀性主要表现在列与列之间，行与行之间的非均匀性相对来说较小。原因在于CMV4000探测器采用多通道传输，各列的列增益存在一定误差，这在工艺上不可避免。按照传统的算法，计算每一个像素点的校正参数，所需参数较多。为减小资源消耗，本文在处理时按列校正。由于探测器各个像素点有独立的增益放大器，它们也存在一定差异，同时数据传输中不可避免会引入噪声，为了消除这些因素的影响，首先对图像进行滤波[4]。

表2 优化发酵条件正交试验结果

由正交试验结果（表2）可知，极差RA＞RC＞RD＞RB，表明四个因素中对阿魏酸产量影响大小的顺序为：菌种＞时间＞温度＞固液比。确定各因素的理论最佳组合为A1B2C3D2，即使用泡盛曲霉，固液比1∶4，28℃下发酵7 d。对理论最佳组合进行验证试验，重复3次，检测阿魏酸含量为（164.3±3.1）μg／g，超过正交试验中的最优结果（A1B2C2D2，155.3μg／g）。

经HPLC检测，未发酵的麦麸的总阿魏酸含量为1 430.2μg／g，其中游离部分仅为10.7μg／g。在最优发酵条件下，游离阿魏酸含量提高了约15倍，占麦麸总阿魏酸的11.5%。

2.2 发酵麦麸多酚提取物的抗氧化能力

2.2.1 超氧阴离子自由基清除率

超氧阴离子自由基（·O-2）能引起脂质过氧化，与衰老密切相关。邻苯三酚（pyrogallol）在碱性条件下释放出超氧阴离子自由基，在325 nm处有吸收峰，有抗氧化剂的存在能使吸光值减小［13］。不同浓度多酚提取物的超氧阴离子自由基清除率如图1。随样品浓度提高，自由基清除率逐渐提高，最高为66.3%。经计算，多酚提取物的IC50值（自由基清除率为50%对应的浓度，与抗氧化能力成反比）20.9μg阿魏酸／mL。

图1 多酚提取物的超氧阴离子自由基清除率

2.2.2 DPPH清除率

DPPH是一种稳定的自由基，有自由基清除剂存在时，DPPH的单电子被捕获，最大吸收光波长处吸光值下降，故用吸光值下降程度来评价抗氧化能力。图2为不同浓度多酚提取物的DPPH清除率，多酚提取物对DPPH有较强的清除能力。阿魏酸浓度为20μg／mL的多酚提取物的DPPH清除率达到了81.5%，继续提高浓度不再有明显变化（最高82.8%）。多酚提取物的IC50值为7.6μg阿魏酸／mL。

图2 多酚提取物的DPPH清除率

羟基自由基（·OH）是化学性质最活泼的自由基，对细胞的危害性最大。Fe2＋与H2O2反应能生成·OH（Fenton反应）［14］，可利用该反应体系检测物质羟基自由基清除能力。图3为不同浓度的多酚提取物对羟基自由基清除试验的结果。随着浓度增加，多酚提取物对羟基自由基的清除率从23.3%提高到73.4%。经计算，羟基自由基的IC50为18.1 μg阿魏酸／mL，大于DPPH自由基IC50（7.6μg阿魏酸／mL），小于超氧阴离子自由基（20.9μg阿魏酸／mL），故多酚提取物清除各种自由基的能力大小依次为：DPPH自由基＞羟基自由基＞超氧阴离子自由基。

图3 多酚提取物的羟基自由基清除率

2.2.4 还原力

还原力是衡量抗氧化能力的重要指标，还原力表示物质提供电子的能力，还原力越强表明抗氧化能力越强。发酵麦麸的多酚提取物的还原力检测结果如图4所示。随着浓度的增加，多酚提取物溶液的还原力从0.260增长至1.011。阳性对照，即0.2 mg／mL的维生素C的还原力结果为0.461，与含10μg／mL阿魏酸的多酚溶液的还原力（OD＝0.451）相近。

图4 多酚提取物的还原力检测

除了阿魏酸，麦麸多酚中还含有香豆酸、丁香酸等其他多种酚酸类物质［15］，这些物质也具有不同程度的抗氧化能力，因此以上试验实际检测到的是多酚提取物的总抗氧化能力。微生物发酵不仅能改变材料原有的活性物质含量，还可能产生新的活性物质，不同活性物质之间相互作用的共同作用可能大于单一物质的抗氧化能力，其相关的发生机制需要进一步深入研究。此外，不同产地、不同品种小麦加工成的麦麸，酚酸类物质组成和含量存在一定差别，发酵工艺也可能需要适当调整。

3 结论

本研究以市售小麦麸皮为底物进行微生物发酵，以阿魏酸含量为评价指标，通过正交试验探究最优发酵条件，明确了最佳发酵条件为：接种泡盛曲霉，固液比1∶4，温度28℃，发酵时间7 d。在此发酵条件下，发酵麦麸中的游离阿魏酸含量为164.3

μg／g，占麦麸总阿魏酸的11.5%。提取发酵麦麸的多酚进行体外抗氧化试验，发现其超氧阴离子清除率、DPPH自由基清除率、羟基自由基和还原力最高分别可达66.3%、82.8%、73.4%和1.011，表明本研究中的麦麸发酵产物具有较强的抗氧化活性，为将来开发发酵麦麸相关的功效产品提供了依据。