ε-PL对水凝胶抗菌性能的影响及表征

闫慧敏， 杨 光， 杨 波， 王 礼

上海理工大学健康科学与工程学院，上海 200093

皮肤作为主要的外部防御系统，具有保护机体免受微生物感染的作用。每年都会有很多的病人因为各种事故导致表皮或皮肤出现不同程度的损伤［1］，因此敷料的选择对损伤皮肤的修复至关重要。传统敷料例如绷带、药棉和纱布等，都能不同程度的吸收伤口渗液，进行伤口管理［2］。同时传统敷料也存在一些不可忽视的缺点，如纱布中的纤维容易脱落失去屏障保护功能，对伤口的愈合会产生一定影响；纱布无法有效吸收伤口渗出液，且换药工作量大，换药时由于伤口与纱布产生粘连，会引起疼痛和二次损伤。

近年来，越来越多的研究趋向于新型伤口敷料领域，新型伤口敷料能够使受损皮肤表面含水量控制在合适的范围内，既不会因为水分过多造成伤口感染，也不会因为过于干燥而影响伤口愈合或引起伤口粘连。新型伤口敷料包括水凝胶、薄膜类、藻酸盐类、泡沫类、水胶体类敷料［3］等，其中水凝胶敷料是一种高分子聚合物，是一种以水为分散介质的凝胶［4］，具有在水中溶胀而不溶解并保持大量水分的特点，能够为伤口提供湿润的环境促进伤口愈合。此外，由于水凝胶特有的柔软性能，使之能加工成各种形状，从而与伤口更有效的接触。因此，研究和开发水凝胶新型伤口敷料具有重要的商业价值［5］。

岳凌等人［6］采用冷冻-解冻法制备出一种加速伤口愈合水凝胶，在制作过程中掺入可局部应用于创面的庆大霉素。但庆大霉素属于一种抗生素，且存在全身毒性（肾毒性）和低血浆浓度的问题阻碍了它的广泛应用。PARK等人［7］采用水溶液浇铸法以聚乙烯醇（PVA）为原料与戊二醛（GA）在盐酸存在下进行化学交联，制备了聚乙烯醇（PVA）水凝胶。但上述水凝胶均存在明显的毒性，生物相容性差。目前，由于伤口愈合环境的特殊性，没有一种单一的敷料能适用于所有的伤口管理，制备复合水凝胶是一种新的解决方法。

海藻酸钠（Sodium alginate，SA）具有无毒、生物相容性好、能够凝胶化和热稳定性强特点［8］。明胶（Gelatin，G）是胶原部分水解后的产物，在生物医学、食品和化学工业中有广泛应用。沙蒿胶（Artemisia sphaerocephala Krasch gum，ASKG）是一种天然植物胶，呈交联结构［9］，具有良好的稳定性、保水性和成膜性［10］，在组织工程方面具有潜在应用价值［11］。抗菌性能是水凝胶作为伤口敷料的一项重要指标，细菌感染会引发炎症，从而延缓伤口愈合，ε-聚赖氨酸（ε-polylysine，ε-PL）是一种天然多肽抗菌剂［12］，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌等具有显著的抑制效果，具有安全性能高，水溶性好，热稳定性好等优点［13］。本文采用共混-离子交联法以海藻酸钠、明胶、沙蒿胶为原料制备具有安全无毒复合水凝胶，并在此基础上添加ε-聚赖氨酸进一步增强其抗菌性能，重点研究了ε-PL含量对复合水凝胶力学性能、溶胀性能、保湿性能、抗菌性能及溶血率的影响，进而评估该复合水凝胶在伤口敷料领域的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

主要材料：明胶，分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司；海藻酸钠，分析纯，上海麦克林生化科技有限公司；沙蒿胶；西安拉维亚生物科技有限公司；ε-聚赖氨酸：上海阿拉丁试剂有限公司；无水氯化钙，分析纯，上海麦克林生化科技有限公司；大肠杆菌和金黄色葡萄球菌来源于上海大学实验室自行分离保存。

主要仪器：Scientz-25T真空冻干机，宁波新芝生物科技股份有限公司；JJ-1电动搅拌器，常州恩培精密仪器有限公司；SMS质构仪TA.XT PLUS，TA Instruments-Waters LLC；TM2101-T5型微电脑式拉力试验机，济南泰钦电气有限公司；DHG-9240A型电热鼓风干燥，上海一恒科学仪器有限公司；Nicolet is 10型傅里叶红外光谱仪，美国产；FEI Quanta 450场发射扫描电子显微镜，美国FEI公司。

1.2 方法

1.2.1 复合水凝胶的制备

称取一定质量的明胶于去离子水中，在50℃恒温水浴锅中搅拌40 min直至均匀，再向其中加入一定质量的沙蒿胶粉，搅拌均匀后制备混合液，之后加入一定量的ε-PL溶液搅拌均匀，pH调节为中性，制备混合液Ⅰ。称取一定质量的海藻酸钠放入去离子水中，在50℃恒温水浴锅中搅拌50 min，静置均匀，制备混合液Ⅱ。之后将两种等体积混合搅拌1 h，倒入模具中放入4℃冰箱过夜去除气泡，然后向其中滴入等体积的2%氯化钙溶液交联8 h，最后用去离子水洗涤三次，即得复合水凝胶［11］。最终G质量浓度为2.5%、SA添加量为1.5%，ε-PL添加量分别为0%、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%，五组样品依次命名为SGAP-0、SGAP-1、SGAP-2、SGAP-3、SGAP-4。

1.2.2 复合水凝胶力学性能的测定

（1）压缩强度

在室温条件下，用十二孔板制备直径20 mm，高5 mm圆柱形水凝胶，用物性分析仪（TA.XT PLUS）对水凝胶试样进行压缩试验直至压破，压缩速率设为0.5 mm／s。每组试样重复五次压缩试验，以减少实验误差［14］。

（2）拉伸性能和断裂伸长率

将制备好的水凝胶用裁刀切成哑铃型，样品总长度为75 cm，测试部位长度为40 mm，宽度为4 mm，用游标卡尺测量样品厚度，将试样的上下两端夹紧到拉力试验机上，以100 mm／min的拉伸速度拉伸并测定拉断时的拉伸强度（KPa）和断裂伸长率（%），每个样品测试三次取平均值［15］。

1.2.3 复合水凝胶溶胀性能测试

将水凝胶于真空冻干机干燥至恒重，取大小、质量相近的干燥凝胶圆片，质量记为M0，将干燥后的凝胶圆片浸泡于去离子水中，每隔一段时间取出擦干表面水分后称重，此时的质量记为Mt，根据公式（1）计算水凝胶的溶胀比SR（%）［16］，计算公式如下：

其中M0和Mt分别为干凝胶和t时刻水凝胶的质量g。

1.2.4 复合水凝胶的保湿性能测试

将冷冻干燥后的样品质量记为m0，浸入去离子水中，充分溶胀后称重，质量记为m1，将充分溶胀后的样品放入37℃恒温干燥箱中，间隔不同时间测量水凝胶的重量，记为mt。根据公式（2）计算各个时间点的保湿率［17］。保湿率计算方式如下：

其中m0、m1和mt分别为干凝胶、充分溶胀后的水凝胶和t时刻水凝胶的质量g。

1.2.5 红外光谱测定

将制备好的水凝胶样品于-45℃预冻4 h，置于真空冷冻干燥机中冷冻48 h后粉碎，利用KBr压片法制得样品进行测试，扫描范围为4 000 cm-1～500 cm-1。

1.2.6 复合水凝胶的SEM测试

将水凝胶经真空冷冻干燥后的样品切片贴在导电胶上，待测样品固定好后对其进行喷金处理，最后将喷金的样品和载样台一同放入扫描电镜的样品室进行形态观察。

1.2.7 复合水凝胶的抗菌性能测试

采用抑菌圈法和OD值法对样品的抗菌性能进行测试。

抑菌圈法：先对细菌进行活化，然后用接种环取一环活化后的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别于10 mL生理盐水中制备菌体浓度为108CFU／mL的菌悬液，然后取大肠杆菌和金黄色葡萄球菌100μL菌悬液均匀涂布于高温灭菌处理过的琼脂培养基上，将灭菌过的直径为1 cm圆柱形样品置于培养基上，在37℃温度下恒温培养24 h，观察抑菌圈的大小。

OD值法：用接种环取一环活化后的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别接种于LB液体培养基中进行培养，培养条件为摇床转速220 r／min，温度37℃，培养时间12 h，测量培养后的菌液在600 nm处的OD值，与LB液体培养基混合，稀释至OD600为0.6左右，然后按1∶1 000比例继续稀释，稀释至浓度约为105CFU／mL，将灭菌后的样品加入到3 mL菌液中，使样品完全浸没在菌液中，设置不添加样品的为空白对照，在220 r／min，37℃光照条件下培养24 h，测定此时600 nm处的OD值。按照公式（3）计算抑菌率。

其中，ODcontrastivegroups为对照组，ODexperimentalgroups为实验组。

1.2.8 复合水凝胶的溶血率测试

按照抗凝兔血：0.9%生理盐水4∶5制备稀释新鲜抗凝兔血，取含有样品的生理盐水混悬液各10 mL于离心管中，在阴性对照中加入10 mL生理盐水，阳性对照中加入10 mL去离子水。将全部离心管放于37℃水浴锅中保温半小时后，在各离心管中加入200μL稀释过的新鲜抗凝兔血，保温1 h，并以3 000 r／min速度离心5 min，取上清液用紫外分光光度计在545 nm处测其吸光度（OD），重复实验三次。溶血率通过OD值按照公式4计算得出：

其中：ODt、ODpc、ODnc分别对照样品组、阳性对照组和阴性对照组。

2 结果分析

2.1 ε-PL对复合水凝胶力学性能的影响

力学性能是水凝胶作为医用敷料的一个重要指标，良好的力学性能能使敷料在使用过程中保持完整性，复合水凝胶的力学性能结果如图1所示。

图1（a）为应力-应变曲线，（b）为最大压缩强度，可以看出，SGAP-1复合水凝胶压缩强度达到最大值为477.6 kPa，随着ε-PL质量浓度的增加，压缩强度呈先增加后降低的趋势。（c）、（d）分别为复合水凝胶的拉伸强度和断裂伸长率，随着ε-PL质量分数的增加，拉伸强度和断裂伸长率均出现先增加后下降的趋势，这与压缩强度一致。原因可能是随着ε-PL的加入，ε-PL中的-NH2与SA和ASKG中的-OH分子间相互作用形成网络结构［18］，使体系结合更加紧密，但随着ε-PL的增加，使分子间-OH的距离增加，破坏了分子间作用力，导致力学性能下降。

图1 ε-PL对复合水凝胶力学性能的影响

2.2 ε-PL对复合水凝胶溶胀性能的影响

水凝胶的溶胀是一个复杂的过程，首先水凝胶基质的极性亲水基团被水化，水以一级结合水的形式出现，水也与暴露的疏水基团相互作用，疏水基团以二次结合水的形式出现。一次结合水和二次结合水都构成总结合水，之后网络向无限稀释方向的渗透驱动力受到物理或化学交联的抵制，因此可以吸收额外的水充满网状或链状空隙和较大孔隙的中心。良好的溶胀性能可以吸收伤口渗出液，有利于伤口的修复和愈合。ε-PL对复合水凝胶溶胀性能的影响见图2。

图2 ε-PL对复合水凝胶溶胀性能的影响

由图2可知，加入ε-PL后，复合水凝胶的溶胀性能呈先降低后增加的趋势，SGAP-0的溶胀率最大，随着ε-PL的加入，溶胀度有所降低，原因可能是ε-PL的加入，使交联网络的密度增加，复合水凝胶体系较为致密，不利于水分子的进入，溶胀性能有所下降［19］，随着ε-PL的继续增加，SGAP-4的溶胀率有所增加，可能的原因是随着ε-PL增加分子内氢键的距离增加，网络孔隙变大，水分子能快速进入，使SPAP-4的溶胀性能有所增加。所制备的水凝胶溶胀度均在500%以上，具有较好的溶胀性能。

2.2 ε-PL对复合水凝胶保湿性能的影响

具有一定的保湿性能伤口敷料，可以为伤口的愈合提供一个湿润的环境，进而加速伤口的愈合，ε-PL对复合水凝保湿性能的影响见图3。由图3可知，随着ε-PL的增加，保湿率呈先增加后降低的趋势，但整体变化趋势不大，180 min后，复合水凝胶保湿率仍在35%以上，复合水凝胶中由于含有大量的亲水基团，增加了水凝胶的润湿性和亲水性特征，容易与水结合，从而防止水分的蒸发，能够为伤口愈合过程中提供一个良好的湿润环境。

图3 ε-PL对复合水凝胶溶胀性能的影响

2.3 红外光谱分析

原料SA、G、ASKG和SGAP-0、SGAP-3的红外光谱如图4所示。由图可知，海藻酸钠光谱中在3 415 cm-1处有一宽峰是—OH的伸缩振动峰，在2 929 cm-1处出现的C—H的伸缩振动峰是海藻酸钠的特征峰。在1 616 cm-1和1 413 cm-1处的吸收峰是羧酸盐（COO—）对称伸缩振动吸收峰［20］。明胶光谱中在1 618 cm-1和1 420 cm-1处出现的峰属于酰胺I和酰胺II［21］，在沙蒿胶光谱中，在3 415 cm-1处出现—OH的宽峰是由于沙蒿胶内含有大量的羟基引起的［22］。在SGAP-0中，海藻酸钠的羧基峰和明胶的氨基峰都明显减弱，这是由于明胶中的氨基和海藻酸钠中的羧基与钙离子之间发生了交联反应［23］，3 300 cm-1～3 600 cm-1范围羟基峰形变的尖锐，其原因在于沙蒿胶中大量的羟基在体系中自身形成氢键使复合水凝胶体系间氢键作用力增强，ε-PL引入后，COO—在1 413 cm-1处的吸收峰明显减弱，原因可能是ε-PL上的氨基与海藻酸钠中的羧基在体系中发生了离子相互作用导致COO—的吸收峰有所减弱［24］。

图4 复合水凝胶红外光谱图

2.4 扫描电镜分析

通过扫描电镜观复合水凝胶的三维网状结构，将SGAP-0、SGAP-3和SGAP-4经过真空冷冻干燥后切片、喷金后进行电镜扫描，分别放大100倍和200倍进行观察，结果见图5。由图可知，所制备的样品均具有互相连接的孔状结构且多孔结构之间的连通性较好，这是由于体系内的羟基形成大量氢键，增强了复合水凝胶中的网络结构，可以为小分子提供良好的通路，使之能够在网络中得到良好的存储，这为复合水凝胶的吸水和保湿提供了结构基础［25］。ε-PL引入后可适当增加复合水凝胶的网状孔结构，但随着ε-PL的增加，水凝胶体系分子间距离增大，导致孔隙变大，使复合水凝胶的力学性能变差，与上文一致。

图5 水凝胶扫描电镜图

2.5 抗菌效果评价

ε-PL的抗菌结果如图6所示，由图（a）可知，SGAP-0没有抑菌圈出现，说明不具有抗菌性能，当加入ε-PL后，开始有抑菌圈的出现，且随着ε-PL的增加抑菌圈越来越明显，抑菌圈直径越来越大。抑菌圈大小如图（b）所示，从图中可以看出，所制备的复合水凝胶具有优异的抗菌性能。ε-PL对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌率如图（c）所示，随着ε-PL的增加，抗菌效果越来越好，SGAP-3和SGAP-4均具有较好的抗菌效果，其中SGAP-3对大肠杆菌（E．coli）和金黄色葡萄球菌（S．aureus）抗菌率分别达到了90.12%和88.35%。ε-PL是一种阳离子多肽，与细菌的细胞膜接触可以增加细胞膜的通透性，并进一步导致细胞质泄露，进而杀死细菌。因此，添加ε-PL可以明显增强水凝胶的抗菌能力。

图6 ε-PL对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌

2.6 溶血率

对于医用材料，一般用溶血率是否大于5%来判断，如果大于5%，说明材料会引发溶血现象，导致机体受到一定伤害，不可以用作医用材料，如果溶血率小于5%，说明材料对溶血的影响很小，不会发生溶血，可以用作医用材料。由图7可知，随着ε-PL的加入，溶血率逐渐增大，原因可能是ε-PL是一种阳离子多肽，阳离子增多会破坏红细胞的细胞膜，导致溶血率增大，但均小于5%，是一种非溶血性材料。

图7 ε-PL对水凝胶溶血率的影响

3 结论

本文采用共混-离子交联法制备水凝胶，并在此基础上引入ε-PL增强其抗菌性能，研究了ε-PL对复合水凝胶力学性能、溶胀性能、保湿性能、抗菌性能和溶血率的影响，结果表明，当ε-PL添加量为0.5%时，制备的复合水凝胶出现了明显的抑菌圈，对大肠杆菌（E．coli）和金黄色葡萄球菌（S．aureus）

抗菌率分别达到了90.12%和88.35%，证明其优秀的抗菌性能。溶血率均低于5%，具有良好的力学性能可用作医用材料。实验证明本文采用的共混-离子交联法制备的抗菌复合水凝胶在伤口敷料领域具有重要的应用价值。