联合早期肠内营养和生态免疫肠内营养对重症急性胰腺炎大鼠肾功能保护作用

逄泽辉 王庆华 (滨州医学院护理学人文教研室，山东 滨州 256603)

重症急性胰腺炎(SAP)是一种发病机制复杂的急危重症，其发生、发展与抗炎因子、促炎因子、细胞凋亡等密切相关〔1〕，对机体微循环产生严重影响，导致肝、肺及肾等相关器官衰竭〔2〕。其急性肾损伤(AKI)发生率高达35%，合并急性肾衰竭(ARF)后病死率明显上升，高达80%〔3〕。早期肠内营养(EEN)指患者入院24～72 h内尽早实行EEN。生态免疫肠内营养(EIN)即在肠内营养的基础上，添加益生菌、谷氨酰胺和精氨酸等对免疫功能有重要影响的免疫营养素辅助治疗〔4〕，从而抑制外源性致病菌和内源性条件致病菌的过度生长和繁殖。本研究旨在探讨联合EEN和EIN对SAP大鼠肾功能保护作用。

1 材料和方法

1.1实验动物及分组 选取健康清洁级雄性SD大鼠120只，体重(250±30)g，由山东济南鹏悦实验动物繁育有限公司提供〔动物合格证号：SCXK(鲁)20140007〕，SD大鼠先在动物实验中心适应性喂养2 w。随机分为4组：正常对照(SO)组，SAP模型(SAP)组，EEN组，EIN组。每组30只，将每组再分为12、24、48 h 3个亚组(n=10)。实验前12 h禁食，自由饮水。

1.2实验动物模型制备 SAP大鼠采用逆行胰胆管注射5%牛磺胆酸钠法制备模型。用10%水合氯醛溶液对大鼠进行腹腔注射麻醉(0.3 ml/100 g)，在剑突下腹正中处纵行约2 cm的手术切口，逐层切开循腔入腹，沿胃窦幽门找到十二指肠，于十二指肠内侧可见片状分布胰腺，进一步寻找十二指肠乳头及透明状胰胆管，给予无损动脉夹夹闭胰胆管近肝端，用尖端磨钝的一次性0.45号静脉输液针经胰胆管十二指肠开口处逆行穿刺入主胰胆管，用无损动脉夹固定针头。向胰胆管内缓慢注入5%牛磺胆酸钠溶液(0.1 ml/100 g)，无菌盐水纱布覆盖手术区，当胰腺发生水肿渗出、局部出现暗红色时，证明造模成功。最后将十二指肠还纳至腹腔内后逐层关腹。术后于大鼠背部皮下注射生理盐水(2 ml/100 g)以补充丢失的体液，术后大鼠自由饮水，但仍禁食。SO组：手术方式同上，但开腹后胰胆管注射等量生理盐水。

1.3营养途径的建立 (1)肠内营养液配制：用百普素(Milupa GmbH，德国)配制，在洁净容器中注入500 ml冷水，加入本品1袋(125 g)，充分混合。其主要成分为：水解乳清蛋白、麦芽糖糊精、植物油、矿物质、维生素、微量元素等。(2)EIN组：在EEN组肠内营养乳剂中加入谷氨酰胺(L-Gln，成都药业股份有限公司)0.4 g/(kg·d)、精氨酸(L-Arg，上海信谊制药厂)0.25 g/(kg·d)、三联活菌制剂(长型双歧杆菌、保加利亚乳杆菌及嗜热链球菌，内蒙古双奇药业股份有限公司)109CFU/d。(3)所有大鼠肠内营养喂养途径采用胃十二指肠置管方法，大鼠术后清醒4 h后给予2 ml生理盐水冲洗肠管，SAP建模后12 h起间歇缓慢泵入营养液(10 min/次，5 ml/1.5 h)，总量逐渐增加至50 ml/24 h，能量达到250 kCal/(kg·d)，并采用微量输液泵维持。营养过程中，观察大鼠适应性，根据情况调整营养液速度。SAP组和SO组经肠内营养管注入等量生理盐水。

1.4方法

1.4.1各组炎症反应指标 分别在各亚组营养支持后12、24、48 h观察大鼠腹腔内各脏器的大体情况，进行腹主动脉采血后处死。血液标本室温静置30 min，然后在4℃下12 000 r/min速度离心约5 min后提取血清，血清于-20℃冰箱保存，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6 、IL-10水平，具体实验步骤按试剂盒说明进行操作。

1.4.2各组肾功能指标 保存于-20℃中的血清，采用全自动生化分析仪进行血清淀粉酶(AMY)、血清血尿素氮(BUN)、血肌酐(Cr)的测定。

1.4.3各组组织学指标 取胰腺和肾脏组织，先用生理盐水冲洗干净，然后4%多聚甲醛固定24 h后，采用石蜡包埋后切片，常规苏木素-伊红(HE)染色处理，光学显微镜下观察组织形态和结构的改变。采用改良的Schmidt等〔5〕病理学评分标准进行评分，对大鼠胰腺组织的病理变化作定量评估和组织学研究。采用Rabb等〔6〕评分标准对各组肾脏组织进行病理学评估，评估由两位实验人员单独进行，取平均值作为最终评分。

1.5统计学方法 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1胰腺组织形态观察 (1)SO组胰腺组织3个时间点无明显变化，胰腺组织为淡粉红色，光泽度较好，无明显坏死和出血等病理改变；(2)SAP组：腹腔可见血性腹水，胰腺组织充血、水肿，且有散在出血点和部分坏死，随时间的进行而加重，表明造模成功。(3)EEN组和EIN组在不同时间点病变程度不同，都可见到胰腺组织光泽变暗、充血和水肿等病变，但腹水、出血和坏死的程度较SAP组明显减轻。且EIN组较EEN组减轻。

2.2光镜观察病理改变

2.2.1各组胰腺组织病理变化 (1)SO组胰腺组织结构清晰，细胞形态正常，无出血坏死；(2)SAP组12 h胰腺组织结构轻度紊乱，间质水肿明显，少量炎性细胞浸润，少许腺泡细胞坏死；24 h胰腺组织结构紊乱，炎性细胞浸润，部分腺泡细胞坏死；48 h胰腺组织结构严重紊乱，间质充血、出血，大量炎性细胞浸润，腺泡大面积坏死。(3)EEN组间质水肿减轻，腺泡坏死减少，炎症细胞浸润程度较SAP组减轻。(4)EIN组弥漫性小叶间水肿、出血坏死灶及炎症细胞浸润较EEN组减轻。见图1。

2.2.2各组肾脏组织病理变化 (1)SO组肾组织结构未见明显异常。(2)SAP组肾组织可见明显异常改变，12 h出现轻度肾小管上皮细胞肿胀，肾小管管腔扩张；24 h肾小管上皮细胞明显肿胀，部分肾小管间质炎性细胞浸润，小管间血管充血；48 h肾小管上皮细胞重度水肿，管腔出血，间质大量炎性细胞浸润，肾小管上皮细胞可见部分坏死。(3)EEN组较SAP组肾小管上皮肿胀程度、肾小管间质炎性细胞浸润程度减轻。(4)EIN组较EEN组间质炎性细胞浸润程度、肾小管上皮细胞充血水肿程度、上皮细胞坏死程度均减轻。见图2。

2.2.3各组胰腺、肾脏组织病理评分 各组胰腺组织标本根据Schmidt评分显示：①各组胰腺病理评分有时间依赖性(均P<0.05)；②EEN、EIN组各时间点胰腺病理评分均明显低于SAP组(P<0.05)；③EIN组各时间点胰腺组织病理评分均明显低于EEN组(P<0.05)。各组肾脏组织标本根据Schmidt评分显示：①各组肾脏病理评分有时间依赖性(均P<0.05)；②EEN、EIN组各时间点肾脏病理评分明显低于SAP组(P<0.05)；③EIN组各时间点肾脏组织病理评分明显低于EEN组(P<0.05)，见表1。

2.3各组AMY、BUN、Cr水平比较 (1)AMY比较：①SO组AMY水平较低，各时间点无明显变化，且各时间点均明显低于其余3组(P>0.05)；②SAP组、EEN组及EIN组24 h AMY水平明显高于12 h,48 h AMY水平明显低于24 h(均P<0.05)；③SAP组、EEN组及EIN组同一时间点AMY水平比较：SAP组>EEN组>EIN组(均P<0.05)。(2)BUN、Cr水平比较：①SO组不同时间点BUN、Cr水平无显著差异(P>0.05)；②各组同一时间点BUN、Cr水平比较:SAP组>EEN组>EIN组>SO组(P<0.05)；③SAP组、EEN组及EIN组BUN、Cr水平呈时间依赖性(均P<0.05)。见表2。

图1 各组营养支持不同时间点胰腺组织病理变化(HE，×100)

图2 各组营养支持不同时间点肾脏组织病理变化(HE，×100)

表1 各组营养支持不同时间点胰腺、肾脏组织病理学评分分)

2.4各组血清TNF-α、IL-6、IL-10水平比较 SO组血清TNF-α、IL-6和IL-10水平较低，在造模后各时间点无显著差异(P>0.05)，且各时间点均明显低于其余3组(P<0.05)；SAP组、EEN组及EIN组24 h TNF-α水平明显高于12 h,48 h AMY水平明显低于24 h(均P<0.05)；SAP组、EEN组及EIN组同一时间点TNF-α水平比较：SAP组>EEN组>EIN组(均P<0.05)；各组同一时间点IL-6水平比较:SAP组>EEN组>EIN组>SO组(P<0.05)，IL-10水平比较：SO组

表2 各组营养支持不同时间点血清AMY、BUN及Cr、TNF-α、IL-6、IL-10水平比较

3 讨 论

由于SAP时机体处于强烈应激状态，微循环功能障碍，难以为机体提供正常的营养及能量供应，可在较短时间内引发细菌转移及炎症瀑布样级联反应，导致全身炎性反应综合征(SIRS)，进而发展为多器官功能障碍综合征(MODS)，对SAP相关肾损伤的发生起关键作用〔7〕。BUN主要经肾小球滤过后由肾小管重吸收，当肾损伤或处于全身炎症反应时，肾小球滤过降低，导致血清BUN表达水平显著上升，从而反映肾损伤的程度和病情的严重程度〔8〕。正常情况下Cr主要通过尿液排出体外，当肾脏功能受损导致对Cr滤过能力降低，从而引起血清Cr上升，可能发展为ARF〔9〕。本研究结果表明EIN联合EEN能有效控制SAP的发展，减轻肾脏组织的进一步损害。可能原因EIN中L-Arg能扩张血管，有效改善胰腺微循环，抑制血小板黏附和聚集，有效抗血栓形成，改善机体的缺血状态〔10〕。亦可参与机体蛋白代谢，抑制炎症细胞因子的生成和胰酶的激活，从而对SAP胰腺本身及肾功能均有一定的保护作用。

细胞因子和炎症介质的持续过量释放是导致SAP持续发展并造成急性ARF的重要原因。由于SAP时机体微循环功能障碍，巨噬细胞、中性粒细胞等白细胞过度激活，释放的大量TNF-α、IL-6等炎症因子导致炎症反应。TNF-α是反映SAP早期严重程度的重要指标，可进入血液促进白细胞在炎症局部聚集并活化，造成胰腺组织损伤和脏器功能紊乱。IL-6可激发白细胞黏附参与SIRS和MODS。IL-10通过抑制巨噬细胞和中性粒细胞的增殖与活化，从而减少炎症因子释放，在SAP治疗及预防中起到修复胰腺损伤的关键作用〔11〕。本研究结果表明EIN联合EEN能下调TNF-α、IL-6促炎细胞因子的释放，有效调节IL-10抗炎因子产生，从而恢复体内抗炎因子与促炎因子之间的平衡，对SAP肾损伤起到治疗作用。郑传明等〔12〕研究发现大量的炎性因子如TNF-α、IL-6 及IL-1β瀑布样释放导致肾脏损伤和加重微循环障碍，同时也是造成高死亡率的主要原因。EIN中谷氨酰胺是机体内最丰富的条件非必需氨基酸，是多种免疫细胞的主要能源物质，提示可能Gln刺激免疫细胞分泌，调节生成细胞因子，能抑制TNF-α、IL-6等炎性因子的分泌，可显著减轻SAP时机体炎症，从而保护组织器官功能。此外EIN营养液中特有的三联活菌片，皆为健康人肠道正常菌群，可在人体肠道中生长繁殖，可抑制并清除肠致病菌对肠上皮细胞的黏附，避免其繁殖，减少肠内菌群的移位，促进肠蠕动及稳定肠黏膜免疫屏障，从而减少或阻断炎症介质和细胞因子的释放，有效预防SAP并发症的发生与发展。