LncRNA SNHG14调控miR-142-5p对寡聚态Aβ诱导的鼠源神经细胞系PC12损伤的影响

沈 杰，严 洁，钟 明，庞睿娟，罗永杰

(成都市第二人民医院 1.神经内科；2.检验科， 四川 成都 610017；3.四川省医学科学院 四川省人民医院 神经内科， 四川 成都 610072)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种与年龄相关的神经退行性疾病，是痴呆症的最常见病因，其严重威胁着全球数百万老年人[1]。AD病因复杂，大量研究表明Aβ在大脑中的异常沉积是AD发病核心，并通过细胞凋亡和炎性反应之间的级联反应诱导神经变性[2]。因此，抑制神经细胞凋亡和炎性反应可能为AD的治疗和预防提供潜在策略。长链非编码RNA(lncRNA)可作为微小RNA(miRNA)的诱饵影响mRNA翻译，在维持细胞生理以及包括神经退行性疾病如AD等一系列人类疾病中发挥关键作用[3]。研究指出lncRNA核内小RNA宿主基因14(SNHG14)在AD患者中高表达，运动可以通过降低SNHG14水平来改善AD小鼠认知障碍和炎性反应活动[4]。生物信息学预测显示miR-142-5p是SNHG14的潜在靶点。研究报道miR-142-5p通过调控自噬和影响细胞活力在体外帕金森病模型中发挥神经保护调节剂作用[5]。然而，SNHG14是否靶向miR-142-5p参与调控AD进展并未阐明。本研究探讨了SNHG14和miR-142-5p在寡聚态Aβ诱导的神经细胞损伤中的作用及其机制，旨在为AD诊断和治疗的潜在生物标志物和治疗靶点提供新的见解。

1 材料与方法

1.1 材料

选择2018年1月至2019年12月在成都市第二人民医院确诊的AD患者41例，其中女15例，男26例，年龄(66.7±7.3)岁。同期选择27例健康体检者作为对照(NC)组、NC组和AD组受试者的年龄、性别无差异，具有可比性。纳入标准：AD患者符合美国神经病学、语言障碍和卒中-老年性痴呆和相关疾病学会诊断标准。健康者以简易精神状态量表评分为标准，检验体检者的认知功能。排除标准：近期有过感染史；自身免疫疾病患者；心脏、肾等重要脏器功能障碍者；肿瘤患者；高血压、糖尿病等慢性病患者。研究符合《赫尔辛基宣言》原则。抽取受试者空腹静脉血5 mL置于肝素采血管，1 h内4 ℃离心取血浆样本，保存于-80 ℃冰箱。

鼠源神经细胞系PC12(ATCC公司)；si-SNHG14、si-NC、miR-142-5p mimics、miR-NC、anti-miR-NC、anti-miR-142-5p、荧光素酶报告质粒(上海生工生物公司)；寡聚态Aβ(Sigma-Aldrich公司)；cDNA合成试剂盒(Thermo Fisher Scientifica公司)；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(TaKaRa公司)；CCK-8试剂盒(南京恩晶生物公司)；FITC-annexin Ⅴ凋亡检测试剂盒(上海泽叶生物公司)；TNF-α酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒、IL-6 ELISA试剂盒和IL-10 ELISA试剂盒(Biovision公司)；羊抗兔IgG、cleaved Caspase-3兔多克隆抗体和磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)兔多克隆抗体(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCR检测AD患者血浆中SNHG14、miR-142-5p水平:先用Trizol试剂提取血浆总RNA，然后用cDNA合成试剂盒进行反转录。用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 进行RT-qPCR检测SNHG14(GAPDH为内参)、miR-142-5p(U6为内参)表达，并采用2-△△Ct法计算相对表达量。SNHG14上游5′-GGGT GTTTACGTAGACCAGAACC-3′，下游5′-CTTCCAAA AGCCTTCTGCCTTAG-3′；GAPDH上游5′-CGCTCT CTGCTCCTCCTGTTC-3′，下游5′-ATCCGTTGACTCC GACCTTCAC-3′；miR-142-5p上游5′-AAAGTAGAAA GCACTAC-3′，下游5′-GAACATGTCTGCGTATCTC-3′；U6上游5′-CCCCTGGATCTTATCAGGCTC-3′，下游5′-GCCATCTCCCCGGACAAAG-3′。

1.2.2 细胞的分组和处理:将PC12细胞用含10%胎牛血清+1%双抗+89% DMEM培养液在饱和湿度、37 ℃、含5% CO2温箱孵育，细胞单层铺满培养皿底部时用胰蛋白酶消化并传代。选择对数期细胞接种24孔板，用脂质体2000将si-SNHG14、si-NC、miR-142-5p mimics、miR-NC、si-SNHG14+ anti-miR-NC、si-SNHG14+anti-miR-142-5p分别转染50%汇合PC12细胞，在转染48 h收集细胞进行后续实验。运用20 μmol/L的寡聚态Aβ孵育PC12细胞24 h建立神经细胞损伤模型[6]，记为模型组。未处理PC12细胞记为对照组。用含20 μmol/L的寡聚态Aβ孵育上述转染细胞，并记为模型+si-NC组、模型+si-SNHG14组、模型+miR-NC组、模型+ miR-142-5p组、模型+si-SNHG14+anti-miR-NC组、模型+si-SNHG14+ anti-miR-142-5p组。

1.2.3 CCK-8法测量细胞增殖抑制率:将未转染和转染后的PC12细胞分别接种于96孔板，细胞数为5×103个/孔，运用20 μmol/L的寡聚态Aβ孵育PC12细胞24 h，每孔补充10 μL CCK-8试剂，37 ℃孵育2 h，然后用酶标仪在450 nm处测量吸光度(A)。增殖抑制率(%)=(1-实验A/对照A)×100%。

1.2.4 流式细胞术测量细胞凋亡:寡聚态Aβ孵育PC12细胞24 h后，用胰蛋白酶消化细胞，随后用200 μL结合缓冲液重悬。加入10 μL FITC-annexin V和5 μL碘化丙啶室温避光染色30 min。1 h上流式细胞仪进行分析，用FlowJo软件分析凋亡细胞比例。

1.2.5 ELISA检测培养液中TNF-α、IL-6和IL-10水平:寡聚态Aβ孵育PC12细胞24 h后，收集细胞上清液。按照ELISA试剂盒说明书分析上清液中TNF-α、IL-6和IL-10水平。

1.2.6 双荧光素酶报告基因实验:将包含miR-142-5p结合位点的SNHG14野生(WT)序列插入pmirGLO报告载体构建WT-SNHG14质粒；同时，构建不含miR-142-5p结合位点的SNHG14突变(MUT)质粒MUT-SNHG14。将这些载体与miR-142-5p mimic或miR-NC共转染到PC12细胞中。转染48 h后，采用双荧光素酶报告基因检测系统检测相对荧光素酶活性。

1.2.7 蛋白质印记法检测cleaved-caspase3蛋白水平:RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，随后进行湿法分离。用5%脱脂奶粉封闭膜1 h，并用cleaved-caspase 3抗体、GAPDH抗体4 ℃孵育10 h，然后用羊抗兔IgG在室温下孵育1 h。用化学发光检测试剂盒检测信号，并使用Image Lab软件对信号强度进行量化。

1.3 统计学分析

3）间接性关联关系。间接性关联是指同一视图或者不同视图档案特征之间存在的不同于同一性关联和相关性关联，需要通过特征关联图路径拓扑关系推导出的关联关系。不失一般性地假设f1,f2,f3∈R，若e1=f1↔f2，e2=f2↔f3则有e=e1°e2=f1↔f3。给定路径e可包含ei的阈值，当e＜δ时，所属路径经过不相邻的结点之间存在间接性关联关系。

2 结果

2.1 SNHG14和miR-142-5p在AD患者血浆中的表达

与NC组比较，AD患者血浆中SNHG14表达水平显著升高(P<0.05)，miR-142-5p表达水平显著降低(P<0.05)(图1)。

A.SNHG14 is highly expressed in the plasma of AD patients; B.miR-142-5p is lowly expressed in the plasma of AD patients(27 normal cases and 41 AD patients)； *P<0.05 compared with NC group图1 NC、AD患者血浆内SNHG14和miR-142-5p表达的检测Fig 1 Detection of SNHG14 and miR-142-5p expression in plasma of NC(n=27) and AD (n=41)

2.2 沉默SNHG14对寡聚态Aβ诱导的PC12细胞损伤的影响

与对照组比较，模型组PC12细胞抑制率、凋亡率、SNHG14表达、cleaved-caspase 3蛋白表达显著升高(P<0.05)，miR-142-5p表达显著降低(P<0.05)；与模型+si-NC组比较，模型+si-SNHG14组PC12细胞抑制率、凋亡率、SNHG14表达、cleaved-caspase 3蛋白表达显著降低(P<0.05)，miR-142-5p表达显著升高(P<0.05)(图2，表1)。

2.3 沉默SNHG14对寡聚态Aβ诱导的PC12细胞中炎性因子的影响

与对照组比较，模型组PC12细胞培养液中TNF-α和IL-6水平显著升高(P<0.05)，IL-10水平显著降低(P<0.05)；与模型+si-NC组比较，模型+si-SNHG14组PC12细胞培养液中TNF-α和IL-6水平显著降低(P<0.05)，IL-10水平显著升高(P<0.05)(表2)。

2.4 SNHG14和miR-142-5p的靶向关系

Starbase预测到miR-142-5p与SNHG14存在连续互补序列，见图3。miR-142-5p mimics和WT-SNHG14共转染细胞的相对荧光素酶活性与miR-NC和WT-SNHG14共转染细胞相比显著降低(P<0.05)(表3)。

A.SNHG14 silencing promotes apoptosis of PC12 cell induced by oligomeric Aβ; B.SNHG14 silencing promotes cleaved-caspase 3 protein expression of PC12 cell induced by oligomeric Aβ

表1 沉默SNHG14对寡聚态Aβ诱导的PC12细胞损伤的检测Table 1 Detection of SNHG14 silencing on PC12 cell damage induced by oligomeric

表2 沉默SNHG14对寡聚态Aβ诱导的PC12细胞中炎性因子的检测

图3 SNHG14和miR-142-5p的互补序列Fig 3 Complementary sequence of SNHG14 and miR-142-5p

2.5 miR-142- 5p对寡聚态Aβ诱导的PC12细胞凋亡、炎性因子表达的影响

与模型+miR-NC组比较，模型+miR-142-5p组PC12细胞miR-142-5p表达、培养液中IL-10水平显著升高(P<0.05)，细胞抑制率、凋亡率、cleaved-caspase 3蛋白表达以及培养液中TNF-α、IL-6水平显著降低(P<0.05)(图4，表4)。

2.6 抑制miR-142- 5p对沉默SNHG14处理的寡聚态Aβ诱导的PC12细胞凋亡、炎性因子表达的影响

与模型+si-SNHG14+anti-miR-NC组比较，模型+si-SNHG14+anti-miR-142-5p组PC12细胞miR-142-5p表达、培养液中IL-10水平显著降低(P<0.05)，细胞抑制率、凋亡率、cleaved-caspase 3蛋白表达以及培养液中TNF-α、IL-6水平显著升高(P<0.05)(图5，表5)。

表3 双荧光素酶报告实验Table 3 Double luciferase report

3 讨论

AD是最严重的神经退行性疾病之一，其开始进展缓慢，随着时间的推移而逐步恶化，阐明AD的发病机制对寻找有效的治疗靶点十分重要。lncRNA是近年来AD相关研究的热点，血浆中lncRNA转移相关肺腺癌转录本1(MALAT1)水平可能是AD患者诊断的潜在生物标志物[7]；lncRNA核富含丰富的转录本1(NEAT1)参与寡聚态Aβ诱导的神经元损伤[8]。SNHG14是研究最广泛的lncRNA之一，其在癌和血管疾病中发挥着重要作用。本研究发现AD患者血浆和寡聚态Aβ诱导的AD细胞模型中SNHG14表达增加，沉默SNHG14可抑制细胞凋亡，促进细胞增殖，下调cleaved-caspase 3表达，表明SNHG14在AD进展中是一种正向调节因子。神经炎性损伤可能加剧AD发病机制，Aβ可激活小胶质细胞并诱导促炎因子大量产生，从而进一步加剧炎性反应[9]。

A.miR-142-5p promotes apoptosis of PC12 cells induced by oligomeric Aβ; B.miR-142-5p promotes cleaved-caspase 3 protein expression of PC12 cells induced by oligomeric Aβ

表4 miR-142-5p对寡聚态Aβ诱导的PC12细胞凋亡、炎性因子表达的影响

A.inhibiting miR-142-5p promotes apoptosis of PC12 induced by silencing SNHG14-treated oligomeric Aβ; B.inhibiting miR-142-5p promotes cleaved-caspase 3 protein expression of PC12 induced by silencing SNHG14-treated oligomeric Aβ

表5 抑制miR-142- 5p对沉默SNHG14处理的寡聚态Aβ诱导的PC12细胞损伤炎性因子的检测

有报道称，SNHG14可促进糖氧剥夺复氧诱导的神经损炎性反应[10]。在帕金森病细胞模型中，SNHG14下调可抑制促炎因子产生和细胞凋亡[11]。与上述发现类似，本研究中沉默SNHG14可促进抗炎因子IL-10水平，降低促炎因子TNF-α和IL-6水平，表明沉默SNHG14可改善寡聚态Aβ诱导的神经炎性损伤。

既往研究报道SNHG14可调节多种miRNA表达[12-13]。本研究发现在AD患者血浆和寡聚态Aβ诱导的AD细胞模型中miR-142-5p表达降低，证实miR-142-5p是SNHG14的直接靶点。miR-142-5p是多种细胞损伤模型的保护因子，miR-142-5p过表达可减轻缺氧引发的心肌细胞凋亡和活力下降[14]。上调miR-142-5p水平能够改善急性肾损伤[15]。本研究发现过表达miR-142-5p可减轻寡聚态Aβ诱导的细胞增殖抑制、细胞凋亡和炎性反应。沉默SNHG14可逆转寡聚态Aβ诱导的miR-142-5p表达下降，抑制miR-142-5p表达显著减弱沉默SNHG14对寡聚态Aβ诱导的细胞凋亡、炎性因子水平的影响，进一步证实SNHG14通过靶向负调控miR-142-5p表达促进寡聚态Aβ诱导的神经细胞损伤，促进AD进展。

综上所述，AD患者血浆中SNHG14表达上调，miR-142-5p表达下调。沉默SNHG14通过上调miR-142-5p水平可抑制寡聚态Aβ诱导的细胞凋亡、炎性反应，从而改善神经元损伤。这些发现可能为SNHG14和miR-142-5p在AD的发生发展中的作用提供新的见解，也可能为AD的治疗提供新的靶点。