非酒精性脂肪肝病模型小鼠的肝脏病理变化及肝细胞获取方法

史冬雪，原佳琪，丁宝锋，王小爽，余 佳

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005)

非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是一种由非酒精因素导致的以肝脏细胞脂肪变性为主要特征的代谢综合征，与较高的脂肪摄入量以及肥胖状态相关联[1]。 NAFLD包括单纯的肝脏脂肪变性(non-alcoholic fatty liver, NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)以及肝纤维化等多个疾病阶段[2]。随着人们饮食结构的不断变化，NAFLD的发病率逐年升高，在全球有超过25%的成年患者群体[3]。由于有着非常复杂的发病机制，人类对NAFLD的治疗仍然面临着巨大的挑战。NAFLD小鼠模型的建立在研究NAFLD的发病机制、寻找潜在诊疗靶点方面发挥了非常重要的作用。

原代肝细胞是多种生物医药研究领域的基础工具细胞，获得高活力且高产量的原代小鼠肝细胞在技术上具有挑战性。目前，获取小鼠原代肝细胞主要基于经典的两步胶原酶灌注技术及其改进方案来实行[4-6]，实验中先用无钙离子的缓冲液灌注肝脏，除去肝脏中的钙离子，打破细胞与细胞之间的连接作用，再用含钙的胶原酶溶液进一步消化，能够获得较高质量的原代肝细胞。但是当肝脏发生脂肪变性时，肝细胞变得脆弱，使用传统的分离方法难以获得高质量原代细胞，且在NAFLD小鼠中获取原代肝细胞的技术仍然少有报道。本研究在传统方法的基础上，通过精准控制温度、降低胶原酶浓度、使用低速离心和低速密度梯度离心等优化，使NAFLD小鼠中肝细胞活性和产量得到提高。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及饲料: 用于建模的C57BL/6J雄性小鼠(江苏集萃药康生物科技有限公司)60只，饲养于中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所动物实验室；普通饲料(xt013，协同生物公司)；高脂饲料(D12492，Research Diets公司)。

1.1.2 主要试剂：DNase Ⅰ(10104159001，Roche公司)；Ⅳ型胶原酶、EGTA、D-(+)-葡萄糖(C5138、E4378、G8270， Sigma公司)；分离液 Percoll(17089102，GE公司)；10×D-Hank’s缓冲液、氯化钙溶液、天狼猩红染色试剂(H1046、G0070、S8060, 索莱宝公司)；煤油(K118401, 阿拉丁公司)；4-羟乙基哌嗪乙磺酸(391338, Merck公司)；RPMI 1640(011001, BI公司)；4%多聚甲醛(P4500, Lablead公司)；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(10100147，Gibco公司)；0.4%锥虫蓝染色剂(T10282，Invitrogen公司)；苏木精伊红(HE)染色试剂盒(C0105S，碧云天公司)。

1.1.3 溶液配方：缓冲液 Ⅰ (Hank’s缓冲液, 5 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，2 mmol/L EDTA(EGTA), 0.1% 葡萄糖, pH 7.4);缓冲液Ⅱ(Hank’s缓冲液, 5 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，5 mmol/L CaCl2, 0.1% 葡萄糖, 0.4 mg/mL Ⅳ型胶原酶, pH 7.4);缓冲液 Ⅲ(RPMI 1640, 2 mmol/L CaCl2, 10% FBS, 1% DNase Ⅰ)。

1.2 方法

1.2.1 NAFLD小鼠模型的建立：将60只7周龄的小鼠平均分成两组：一组饲喂正常饲料(chow diet, CD)，作为对照组，另一组饲喂高脂饲料(high-fat diet, HFD)，作为实验组。

1.2.2 肝脏组织形态学的检测：取1 cm×1 cm×0.5 cm的小鼠肝脏组织，使用10倍体积的4%多聚甲醛固定后，进行石蜡包埋，取5 μm的切片进行HE染色和天狼猩红染色，评估其形态学的改变。

1.2.3 NAFLD小鼠肝脏细胞的获取：1)缓冲液Ⅰ和缓冲液Ⅱ在42 ℃水浴中预热，缓冲液 Ⅲ在冰上预冷。

2)麻醉小鼠：①制作30%异氟烷混合液[异氟烷∶煤油=3∶7(v/v)]。②在500 mL透明小室中，放入1 mL异氟烷混合液润湿的纱布，小鼠在小室中麻醉1～2 min，待其翻正反射消失时取出。③用500 μL异氟烷混合液浸湿少许纱布，塞入50 mL离心管中，制作持续麻醉小鼠的鼻锥管。固定好小鼠，将鼻锥管靠近小鼠鼻子。

3)灌注及消化：①调整蠕动泵流速为20 mL/min，导管两端同时插入缓冲液Ⅰ中，启动蠕动泵排尽导管中气泡备用。②插管: 用酒精消毒小鼠腹部，剪开腹部皮肤，向右翻开肠团，暴露出连接肝脏且位于肠系膜上的肝门静脉。用手术线将门静脉打虚结，将剪掉双翼的留置针从下部小心插入门静脉，旋紧留置针和导管接头，缓慢转动留置针使导管位置摆正, 单手按压留置针固定。打开肝脏上方的加热灯，调整到约20 cm的高度(图1)。③调整蠕动泵流速为5 mL/min，用缓冲液Ⅰ 30 mL从门静脉灌注肝脏，肝脏迅速膨起且颜色均匀变浅即为插管成功，此时迅速剪断下腔静脉释放压力。④更换缓冲液为缓冲液Ⅱ。每隔几十秒用镊子夹住下腔静脉5 s，保证液体对肝脏进行充分灌注，夹住时可以看到肝脏变肿胀。随着原位消化的进行，肝脏外观会迅速变化，包括起伏变小、整体变大、边缘模糊、肝脏根部有细小裂纹，灌注6～8 mL时，肝脏恰好不能再隆起时即为消化终点，此时迅速拔出留置针，关闭蠕动泵。 ⑤ 在35 mm平皿中准备不含Ⅳ型胶原酶的缓冲液Ⅱ 5 mL，加入DNase Ⅰ 50 μL。从根部取下肝脏，放入皿中，小心去除胆囊。用镊子扯开肝包膜，轻轻晃动以释放肝细胞，此时肝细胞应如云雾状分散开。⑥将肝细胞悬液小心转移到50 mL离心管中，置于冰上，用缓冲液Ⅲ 35 mL终止消化，轻轻颠倒几次后，使用100 μm尼龙滤网过滤。

图1 小鼠肝脏原位灌注示意图Fig 1 Schematic diagram of in situ digestion in mice

4)分离细胞：① 肝细胞悬液过滤后，50×g离心3 min。获得的细胞沉淀重悬于20 mL缓冲液Ⅲ，铺在20 mL 40% Percoll 上，200×g离心10 min，以去除细胞碎片和非实质细胞。细胞沉淀用20 mL Hank’s缓冲液洗涤两次，50×g离心3 min。所得沉淀即为原代肝细胞，加入适量Hank’s缓冲液重悬待用。②锥虫蓝染色确定细胞的活性。

5)注意事项：①由于蠕动泵的导管会沉积缓冲液中的钙离子，术者需要定期用低浓度醋酸溶液清洗导管，否则胶原酶的消耗量会随着钙离子的沉积而逐渐增加。②进行肝脏原位消化时，由于小鼠个体差异，消化的时间不是一个定值，观察消化终点十分重要，决定了肝细胞的产量和活性。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 正常(CD)组和高脂(HFD)组小鼠体质量变化

在造模的不同时间点，CD组和HFD组小鼠平均体质量均逐渐增长，HFD组增长幅度较大，显著高于CD组 (P<0.01)(图2)。

2.2 正常(CD)组和高脂(HFD)组小鼠肝脏病理特征观察

2.2.1 小鼠肝脏HE染色结果:CD组肝脏结构完整，可见肝窦肝索，围绕中央静脉呈辐射状排列；肝细胞呈圆形，细胞核位于肝细胞中央，胞质呈淡粉染色；肝脏间质未见炎性反应(图3A)。

*P<0.01 compared with CD group图2 CD组和HFD组的小鼠不同造模时间的平均体质量Fig 2 The average body weight of CD group and HFD group mice at different n=6)

HFD组肝脏在第5周时出现轻微空泡变性，胞质内可见少量细小脂滴(图3B)；第10周时，肝细胞肿胀变性，胞质内存在大小不一的空泡，脂滴增多(图3C)；第15周时，肝细胞胞质内可见大量圆形细小脂滴结构，部分肝细胞胞质完全被脂滴挤压至消失，细胞核被挤压至细胞一侧，脂肪变性面积占1/3以上(图3D)；第20周时， 病变细胞体积较大， 胞质被大量脂质物质充盈，呈淡粉至透明染色，细胞核体积小，有些细胞核被挤压至细胞一侧，脂肪变性细胞占整个组织的50%以上(图3E)。

2.2.2 小鼠肝脏天狼猩红染色结果:CD组小鼠肝脏的天狼猩红染色呈阴性，肝细胞及间质内未见天狼猩红阳性反应，仅在血管壁(含胶原纤维)可见红色染色的阳性细胞(图4A)。

HFD组小鼠第5、10、15周的肝脏天狼猩红染色呈阴性，肝脏中央静脉及其周围胆管的管壁内胶原纤维成分呈红色阳性染色，肝小叶间结缔组织未见阳性，未形成纤维化(图4B～D)；第20周的小鼠肝脏天狼猩红染色呈弱阳性，肝细胞间质可见少量红染的胶原纤维，血管壁(含胶原纤维)可见红色染色的阳性细胞(图4E)。

2.3 高脂(HFD)组小鼠原代肝细胞的获取

传统方法中，每只NAFLD小鼠获得的肝细胞数目<2×107个，细胞存活率<60%，细胞纯度<60%。肝细胞肿胀变大，边缘粗糙，且有较多非实质细胞混杂(图5A)；经过优化的本研究方法中，每只NAFLD小鼠可获得5×107～7×107个肝细胞， 细胞存活率≥85%，细胞纯度≥95%。新鲜分离的肝细胞透亮，呈圆形或椭圆形，边缘平滑，聚团少(图5B)。

A.hepatocytes of mice in the CD group (×10); B.hepatocytes of mice at week 5 in the HFD group(×100); C.hepatocytes of mice at week 10 in the HFD group(×20); D.hepatocytes of mice at week 15 in the HFD group(×100); E.hepatocytes of mice at week 20 in the HFD group(×100)

A.hepatocytes of mice in the CD group (×10); B.hepatocytes of mice at week 5 in the HFD group(×100); C.hepatocytes of mice at week 10 in the HFD group(×10); D:hepatocytes of mice at week 15 in the HFD group(×100); E.hepatocytes of mice at week 20 in the HFD group(×100)

A.hepatocytes obtained by conventional methods(×40); B.hepatocytes obtained by the optimized methods(×40)图5 小鼠原代肝细胞的形态学观察Fig 5 Morphology of primary mouse hepatocytes

3 讨论

由于人类饮食结构的改变，全球NAFLD患者逐年增多。据报道, 50%的NAFLD患者会进展为肝纤维化，少数会发展成肝硬化，甚至最终进展为肝衰竭[7]。本研究模拟人类发病原因，利用高脂饮食诱导了NAFLD的小鼠模型，其中CD组小鼠无明显脂滴沉积，未形成脂肪肝；HFD组小鼠由于饮食的改变，肝脏发生脂肪变性，病变面积随着时间的延长逐渐增加，在15周时开始超过1/3，NAFLD模型构建成功[8]，到20周时脂肪变性面积已达50%以上，甚至开始出现肝纤维化。

NAFLD原代肝细胞接近机体肝脏病理状态，在发病机制及药物代谢等研究中扮演重要角色[9]。NAFLD 原代肝细胞相对于正常原代肝细胞更加脆弱, 难以分离，并且目前获取NAFLD 原代肝细胞的研究仍比较少。本研究以经典的 Seglen 两步灌流法为基础[4-6]，改进得到了一种可以获得高产量、高活性、高纯度NAFLD原代肝细胞的方法。

在原位灌注小鼠肝脏时，本方法首先精准控制了消化的温度，将缓冲液Ⅰ和缓冲液Ⅱ进行42 ℃预热，麻醉时在肝脏上方使用加热灯加热，最大限度保证了消化酶的工作温度接近37 ℃，一方面减少了对肝细胞的刺激，另一方面使消化酶更好地发挥作用，节省了Ⅳ型胶原酶的用量。其次，本研究将Ⅳ型胶原酶的浓度由传统方法中的0.6 mg/mL降到0.4 mg/mL，使得消化更加温和，容易找到一个更加精确的消化终点，既获得了高产量的肝细胞，又提高了肝细胞的存活率。

对于体外分离肝细胞，目前大多实验室主要采用直接静置和密度梯度离心两种方法，直接静置会导致肝细胞纯度下降，掺入过多肝脏非实质细胞。而常规的密度梯度离心由于离心力较大，往往对肝细胞的活性产生影响。普通肝细胞分离使用50% Percoll分离液，脂肪肝细胞由于有脂滴沉积而导致密度下降，故而采用常规的分离液浓度会降低肝细胞的产量。本研究采用低速(200×g)密度梯度离心和普通低速离心(50×g)相结合的方式，使用40% Percoll分离液，使肝细胞的活性、产量和纯度进一步得到提高。

综上，本研究构建了NAFLD的小鼠模型，揭示了第5、10、15和20周小鼠肝脏的病理特征，并构建了一种高效、稳定的获取高质量NAFLD小鼠肝细胞的实验方法，对小鼠模型中NAFLD的进一步研究有一定参考价值。