益生菌联合不同强度有氧运动对2型糖尿病大鼠骨骼肌脑源性神经营养因子、NF-κB及肾脏脂体比、脂肪量的影响

马丁　卢富琨　熊小芹　马昌军

【摘要】 目的：探討益生菌联合不同强度有氧运动对2型糖尿病大鼠骨骼肌脑源性神经营养因子（BDNF）、核因子-κB（NF-κB）、肾脏脂体比、脂肪量的影响。方法：选取60只清洁级雄性C57/BL大鼠，造模成功后将2型糖尿病大鼠采用随机数字表法分为五组，分别为模型组、A组（益生菌）、B组（益生菌+运动A强度）、C组（益生菌+B强度）、D组（益生菌+C强度）。A组、B组、C组、D组每日灌胃嗜酸乳杆菌1 mL（益生菌数量为1×10 CFU/mL），B组、C组、D组都给予跑台有氧运动训练，分别按10、20、40 m/min速度进行跑台训练，每天训练1 h。五组大鼠治疗观察时间为8周。比较五组大鼠的血糖、胰岛素抵抗水平、肾脏脂肪量和脂体比、白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、BDNF、NF-κB水平。结果：治疗4、8周，A组、B组、C组、D组的空腹血糖与胰岛素抵抗水平均低于模型组，且D组均低于A组、B组、C组，C组均低于B组、A组，B组均低于A组，差异均有统计学意义（P<0.05）。治疗8周，A组、B组、C组、D组的肾脏脂肪量和脂体比、血清IL-1β、TNF-α含量、腓肠肌BDNF与NF-κB蛋白相对表达水平均低于模型组，且D组均低于A组、B组、C组，C组均低于B组、A组，B组均低于A组，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：益生菌联合不同强度有氧运动在2型糖尿病大鼠中应用，能抑制腓肠肌BDNF与NF-κB蛋白的表达，还可抑制血清炎症因子的释放，从而改善大鼠的血糖与肾脏脂体比、脂肪量。

【关键词】 益生菌 有氧运动 2型糖尿病 腓肠肌 脑源性神经营养因子 核因子-κB

Effect of Probiotics Combined with Different Intensities of Aerobic Exercise on Skeletal Muscle Brain-derived Neurotrophic Factor， NF-κB， and Renal Lipid-to-body Ratio and Fat Mass in Type 2 Diabetic Rats/MA Ding， LU Fukun， XIONG Xiaoqin， MA Changjun. //Medical Innovation of China， 2022， 19（14）： 024-028

[Abstract] Objective： To investigate the effects of probiotics combined with different intensities of aerobic exercise on skeletal muscle brain-derived neurotrophic factor （BDNF）， nuclear factor-kappa B （NF-κB）， and renal lipid-to-body ratio and fat mass in skeletal muscle of type 2 diabetic rats. Method： A total of 60 clean-grade male C57/BL rats were selected， after modeling they were randomly divided into 5 groups， model group， group A （probiotics）， group B （probiotics + exercise intensity A）， group C （probiotics +exercise intensity B）， and group D （probiotics + exercise intensity C）. Group A， group B， group C and group D were given 1 mL lactobacillus acidophilus （probiotics amount was 1×10 CFU/mL） by intragastric administration. Group B， C and D were given treadmill aerobic exercise training at 10， 20 and 40 m/min， respectively， for 1 h every day. The rats in the five groups were treated for 8 weeks. The levels of blood glucose， insulin resistance， renal lipid-to-body ratio and fat mass， interleukin-1β（IL-1β）， tumor necrosis factor-α（TNF-α）， BDNF and NF-κB were compared among five groups. Result： After 4 and 8 weeks of treatment， the levels of fast blood glucose and insulin resistance in the group A， group B， group C and group D were lower than those in the model group， and those in the group D were lower than those in the group A， group B and group C， those in the group C were lower than those in the group B and group A， and those in the group B were lower than those in the group A， the differences were statistically significant （P<0.05）. After 8 weeks of treatment， the kidney fat content， lipid-to-body ratio， serum IL-1β and TNF-α contents， and the relative expression level of BDNF and NF-κB protein in gastrocnemius muscle in the group A， group B， group C and group D were lower than those in the model group， and those in the group D were lower than those in the group A， group B and group C， those in the group C were lower than those in the groups B and group A， and those in the group B were lower than those in the group A， the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion： The application of probiotics combined with different intensities of aerobic exercise in type 2 diabetic rats can inhibit the expression of gastrocnemius muscle BDNF and NF-κB protein， and can also inhibit the release of serum inflammatory factors， thereby promoting the improvement of blood sugar and renal lipid-to-body ratio and fat mass in rats.

[Key words] Probiotics Aerobic exercise Type 2 diabetes Gastrocnemius muscle Brain-derived neurotrophic factor Nuclear factor-κB

First-author’s address： Bazhong Central Hospital， Sichuan Province， Bazhong 636000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2022.14.006

当前糖尿病的发病率逐年增加，特别是在我国，发病人数已超亿人，已成为重要的医学和公共卫生问题。2型糖尿病为糖尿病的主要类型，占80.0%以上。运动可提高胰岛素的敏感性和作用效果，这使得运动成为治疗2型糖尿病的主要非药物手段[1]。有研究发现有氧运动改善血糖代谢的效果优于无氧运动，而无氧运动改善血脂代谢的效果优于有氧运动[2-3]。现代研究表明，肠道菌群的失衡与糖尿病的发生与发展有着密切的关系，鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌等部分益生菌能在改善肠道微生态平衡的同时改善机体的胰岛素抵抗，降低体内促炎性因子，从而改善糖尿病患者的临床症状[4-5]。脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）在骨骼肌、神经组织中均广泛存在，特别是BDNF可通过旁分泌的作用形式调节胰腺β细胞活性，还可激活AMPK/CREB/PGC-1α信号通路，参与血糖代谢，并促进脂肪代谢[6]。核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）是炎症级联反应的重要启动因素，其活化可产生大量炎症因子，引起骨骼肌萎缩，导致骨骼肌炎症反应，也可参与调节血糖代谢[7-8]。本文具体探讨了益生菌联合不同强度有氧运动对2型糖尿病大鼠骨骼肌BDNF、NF-κB及肾功能的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 选取60只清洁级雄性C57/BL大鼠，3周龄，体质量200～210 g，购自北京维通利华实验动物有限公司，实验动物所有喂养程序与实验处理过程由巴中市中心医院实验动物中心管理。饲养条件：饲养与实验过程环境稳定，大鼠摄食、进水，12 h︰12 h灯光进行白天与昼夜循环，相对湿度（55±5）%，室温（25±2）℃。链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（生产厂家：美国Sigam公司，货号：S0130，规格：1 g/瓶），益生菌-嗜酸乳杆菌（lactobacillusacidophilus，HCCB20535）（生产厂家：通化金马药业集团股份有限公司，国药准字：H10940114，规格：0.5 g/片），抗BDNF抗体、抗NF-κB抗体购自Epitomics公司，生化分析仪购自NeoBioscience公司，白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）与肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）检测试剂盒购自大连Takara公司，HRP标记山羊抗兔抗体购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司。本研究经本院动物伦理和使用委员会审批。

1.2 方法 （1）2型糖尿病大鼠模型的建立。所有大鼠适应性喂养1周后进行适应性训练，通过高脂高糖饮食喂养8周后，采用一次性小剂量链脲佐菌素，称取链脲佐菌素适量，加入生理盐水使溶解，配制成浓度为30 mg/kg，腹腔注射1 mL诱导模型。高脂高糖饲料配方：44.0%糖、16.0%蛋白质、40.0%脂肪。造模成功标准：链脲佐菌素注射后第5天禁食12 h后尾静脉取血，测定葡萄糖含量，空腹血糖≥11.1 mmol/L判定为建立2型糖尿病大鼠模型成功，本次研究所有大鼠都造模成功。（2）将2型糖尿病大鼠采用随机数字表法分为五组，分别为模型组、A组（益生菌）、B组（益生菌+运动A强度）、C组（益生菌+B强度）、D组（益生菌+C強度）。A组、B组、C组、D组每日灌胃嗜酸乳杆菌，分别称取嗜酸乳杆菌适量，加入生理盐水使溶解，配制成浓度为益生菌数量为1×109 CFU/mL，均给药1 mL，模型组灌胃等剂量的纯净水，每天给药1次。B组、C组、D组都给予跑台有氧运动训练，分别按10、20、40 m/min速度进行跑台训练，每天训练1 h，A组与模型组不给予针对性跑台有氧运动训练。五组大鼠治疗观察时间为8周。

1.3 观察指标 （1）比较五组大鼠治疗前和治疗4、8周的空腹血糖和胰岛素抵抗水平。（2）比较五组大鼠肾脏脂肪量和脂体比。所有大鼠在治疗8周后处死，取肾脏脂肪组织进行称重，脂肪量=肾周脂肪+肾膜脂肪;脂体比（%）=（肾周脂肪+肾膜脂肪）/体重×100%。（3）比较五组大鼠治疗8周的IL-1β、TNF-α含量。取处死大鼠的眼底动脉血1 mL左右，3 000 r/min离心，10 min，分离血清，采用酶联免疫法检测血清IL-1β、TNF-α含量。（4）比较五组大鼠治疗8周的腓肠肌BDNF和NF-κB水平。取处死大鼠的腓肠肌，剪碎研磨后提取总蛋白，定量蛋白浓度后进行上样电泳、转膜和封闭，加入抗BDNF抗体和抗NF-κB抗体，孵育后再加入二抗，采用发光法显影得到Western blot条带，计算相对表达水平。

1.4 统计学处理 采用SPSS 25.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验，多组间对比为单因素方差分析（One-Way ANOVA），以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 五组大鼠血糖与胰岛素抵抗水平比较 治疗4、8周，A组、B组、C组、D组的空腹血糖与胰岛素抵抗水平均低于模型组，且D组均低于A组、B组、C组，C组均低于B组、A组，B组均低于A组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.2 五组治疗8周的肾脏脂肪量与脂体比比较 治疗8周，A组、B组、C组、D组的肾脏脂肪量与脂体比均低于模型组，且D组均低于A组、B组、C组，C组均低于B组、A组，B组均低于A組，差异均有统计学意义（P<0.05），见表2。

2.3 五组血清IL-1β、TNF-α含量比较 治疗8周，A组、B组、C组、D组的血清IL-1β、TNF-α含量均低于模型组，且D组均低于A组、B组、C组，C组均低于B组、A组，B组均低于A组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表3。

2.4 五组腓肠肌BDNF与NF-κB蛋白相对表达水平比较 治疗8周，A组、B组、C组、D组的腓肠肌BDNF与NF-κB蛋白相对表达水平均低于模型组，且D组均低于A组、B组、C组，C组均低于B组、A组，B组均低于A组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表4。

3 讨论

2型糖尿病已成为全国乃至全球性的健康问题，药物治疗能够有效降低血糖水平，但是需要长期用药，且部分患者容易产生耐药及肠功能紊乱等副作用，为此在临床上需要合理选择非药物治疗方法[9]。益生菌除了具有改善胃肠功能的作用外，还具有降低血糖的作用。有研究显示，益生菌能有效增强机体的口服糖耐量，降低餐后血糖浓度。同时益生菌还可预防2型糖尿病患者非致病性大肠杆菌向组织黏附与转移，避免病情的恶化[10]。本研究显示治疗4、8周，A组、B组、C组、D组的血糖与胰岛素抵抗水平均低于模型组，且D组均低于A组、B组、C组，C组均低于B组、A组，B组均低于A组（P<0.05）。治疗8周，A组、B组、C组、D组的肾脏脂肪量与脂体比均低于模型组，且D组均低于A组、B组、C组，C组均低于B组、A组，B组均低于A组（P<0.05），表明益生菌联合有氧运动在2型糖尿病大鼠的应用能改善血糖，降低肾脏脂肪量与脂体比。当前也有研究表明，运动可提高胰岛素的敏感性和作用效果，可减少胰岛素抵抗，加快糖、脂氧化分解，促进糖原合成，从而降低血糖水平。特别是有氧运动可通过增加肌肉中葡萄糖转运蛋白4含量和改善胰岛素敏感性等机制，增加骨骼肌对葡萄糖摄取能力，进而起到调控血糖的作用[11-12]。

糖尿病患者体内长时间高血糖状态会促使葡萄糖发生糖化反应，可以毒伤神经元，造成患者病情恶化。益生菌不但能明显减少肝糖原的积累，还能够改善大鼠糖耐量受损，从而在一定程度上降低胰岛素水平[13]。还有研究显示益生菌能有效控制摄入高果糖大鼠体重的增加，改善高胰岛素血症大鼠高胰岛素水平，降低大鼠空腹胰岛素水平，提高口服耐糖能力[14]。本研究显示治疗8周，A组、B组、C组、D组的血清IL-1β、TNF-α含量均低于模型组，且D组均低于A组、B组、C组，C组均低于B组、A组，B组均低于A组（P<0.05），表明益生菌联合有氧运动在2型糖尿病大鼠的应用能抑制炎症因子的释放。从机制上分析，IL-1β、TNF-α的大量释放可导致骨骼肌炎症反应，影响骨骼肌能量代谢，引起骨骼肌萎缩[15]。有氧运动能明显改善糖尿病大鼠的糖脂代谢，能抑制糖尿病大鼠骨骼肌AGE-RAGE轴通路，降低其氧化应激和炎症反应，减轻骨骼肌损伤，改善血糖代谢[16-17]。

BDNF主要表达在神经系统组织中，参与调节调控神经元再生和突触可塑性、神经损伤修复等过程。BDNF也存在于骨骼肌、血管等组织中，具有改善骨骼肌胰岛素抵抗、提高骨骼肌细胞脂肪氧化能力、调节肌纤维类型分化等作用。抑制骨骼肌中BDNF的表达，可激活AMPK/CREB/PGC-1α信号通路，减少胰岛素抵抗和骨骼肌萎缩，促进脂质氧化。NF-κB是糖尿病骨骼肌炎症反应中重要的调节因子，其活化后可导致骨骼肌萎缩和胰岛素抵抗，将启动和调节炎症因子的转录，参与骨骼肌炎症反应。本研究显示治疗8周，A组、B组、C组、D组的腓肠肌BDNF与NF-κB蛋白相对表达水平均低于模型组，且D组均低于A组、B组、C组，C组均低于B组、A组，B组均低于A组（P<0.05），表明益生菌联合有氧运动在2型糖尿病大鼠的应用能抑制腓肠肌BDNF与NF-κB蛋白的表达。当前有研究表明有氧运动可抑制糖尿病大鼠骨骼肌中BDNF的表达，提高脂肪氧化水平，进一步激活AMPK/CREB/PGC-1α信号通路，调节血脂代谢[18-19]。同时其能更好地抑制骨骼肌中NF-κB蛋白的表达，提高骨骼肌糖代谢能力，降低骨骼肌炎症和肌萎缩。本研究由于经费限制，没有对其他动物模型进行分析，也没有设置空白组，将在后续研究中探讨。

综上所述，益生菌联合不同强度有氧运动在2型糖尿病大鼠的应用能抑制腓肠肌BDNF与NF-κB蛋白的表达，还可抑制血清炎症因子的释放，从而促进改善大鼠的血糖与脂体比、脂肪量。

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（收稿日期：2021-11-19） （本文编辑：张明澜）