与牙髓干细胞相关的骨组织工程研究进展

魏代福　魏馨蕊　赵戬

【摘要】 牙髓干细胞来自成人或儿童的牙髓组织，非常容易获得，且具有良好的增殖分化能力，被认为是在组织再生领域最有应用潜力的干细胞之一。牙髓干细胞在骨组织工程领域的研究由来已久，本文就牙髓干细胞的成骨分化潜能、相关的动物实验和临床试验、炎症牙髓干细胞和同种异体牙髓干细胞几个方面的研究进展作综述。

【关键词】 牙髓干细胞 组织工程 成骨分化 骨再生

Advances of Bone Tissue Engineering Related to Dental Pulp Stem Cells/WEI Daifu， WEI Xinrui， ZHAO Jian. //Medical Innovation of China， 2022， 19（14）： -175

[Abstract] With excellent multilineage differentiation potential and high proliferation rate， dental pulp stem cells are considered as one of the most promising stem cells in the field of tissue engineering， which can be easily obtained from dental pulp tissues of adults and children. Potential applications of dental pulp stem cells in bone tissue engineering have been studied for a long time， and this article mainly discusses it’s osteogenic differentiation potential， relevant animal experiments and clinical trials， as well as allogenic pulp stem cells and stem cells derived from inflammatory dental pulp tissues.

[Key words] Dental pulp stem cells Tissue engineering Osteogenic differentiation Bone regeneration

First-author’s address： School and Hospital of Stomatology， Laborartory of Periodontics， China Medical University， Shenyang 110002， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2022.14.042

組织工程是基于细胞或蛋白质与生物材料相结合来生成新组织的多学科领域，其中，骨组织再生一直以来都是学者努力探索的方向。成体干细胞是在成体组织或器官中发现的未分化细胞，可以自我更新，并能够分化成多种细胞系的细胞。从各个组织中分离出的干细胞具有不同的生物特性以及不同的成骨分化能力，其中骨髓来源的干细胞是被研究最多的一种，而来源于牙髓的干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）也因为其优秀的成骨分化潜能和易获得性受到广泛研究，来自脱落乳牙牙髓的干细胞（stem cells from exfoliated deciduous teeth，SHED）同样具有多向分化的能力。有研究表明，在生长因子、转录因子和受体分子的调控下，DPSCs可以分化成成骨细胞、脂肪细胞、成牙本质细胞以及神经细胞等[1]。

1 牙髓干细胞的成骨分化能力

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）促进骨再生主要与其成骨分化能力有关。造血干细胞和MSCs产生引起骨吸收的破骨细胞和介导骨形成的成骨细胞，对于骨组织的重建至关重要。骨组织内的MSCs在未受到组织损伤和骨改建重塑的信号刺激时，一般都是处于相对静止的状态，而在受到一些成骨相关刺激因子（如骨成型蛋白）刺激后，可立即分化成成骨细胞。牙髓干细胞的成骨分化潜能已经被文献证实，地塞米松、L-抗坏血酸和β-甘油磷酸补充剂可以广泛诱导其向成骨细胞分化。为了进一步证实其成骨分化能力，骨特异性蛋白如碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、骨钙素、骨桥蛋白、Osterix和矮小相关转录因子2（runt-related transcription factor 2，Runx2）的表达也已被证实[2]。

许多基因和生长因子都可以调节牙髓干细胞成骨分化。除了Runx2等早已认为是MSCs成骨分化中关键的转录因子外，近些年研究发现，HOX转录因子在胚胎发育过程中能够调节骨骼模式，并在成人骨组织中表达，HOX基因在成人骨组织再生和骨折愈合过程中起到重要作用[3]。微核糖核酸（MicroRNAs）可以通过调节转化生长因子-β/骨成型蛋白和Wnt/β-catenin信号通路来调节成骨分化基因表达[4]。Jauković等[5]探究白细胞介素-17和碱性成纤维细胞生长因子对DPSCs和SHED的影响时发现，前者对DPSCs和SHED的早期成骨分化起促进作用，然而后者则起到了较为强烈的抑制作用。还有学者发现LncRNA LEF1-AS1的表达与DPSCs的成骨分化有关，并且其过表达能够促进成骨分化，可与mi-R-24-3p协同作用来调节骨再生进程[6]。

2 动物实验

近些年来，有关牙髓干细胞成骨的动物实验研究有许多报道，主要可以归纳到以下几个方面。

2.1 DPSCs促进骨再生的有效性 近些年，学者们开展了大量的动物实验来探究牙髓干细胞的体内成骨分化能力，包括DPSCs/SHED与羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）或β-磷酸三钙（β-tricalcium phosphate，β-TCP）等支架材料植入免疫缺陷动物的胫骨、颅骨、颌骨以及皮下等处的研究[1]。有许多实验比较了单独应用支架材料和联合应用支架材料及DPSCs/SHED对骨缺损区治疗效果的差异[7-11]，大多数动物实验的结果都显示了人类牙髓干细胞优秀的成骨能力，与支架复合可以产生比单独使用支架材料更大的骨增量。也有少数实验未发现牙髓干细胞明显的体内成骨优势，如Annibali等[7]将β-TCP单独植入和联合DPSCs植入小鼠颅骨缺损区，12周后通过Micro-CT和正电子成像术比较分析新生骨密度差异，发现二者无明显差异，推测可能是DPSCs发挥成骨分化作用的最佳条件未满足。

2.2 DPSCs促进骨再生的机制探索 为了阐明MSCs植入体内后是直接通过成骨分化参与骨再生进程还是通过旁分泌效应间接促进骨再生，Collignon等[12]将荧光标记的小鼠牙髓干细胞载入胶原，并植入到小鼠颅顶缺损处。通过免疫组化分析发现DPSCs在移植后3个月出现在愈合的缺损中，并且它们在软骨细胞样细胞中迅速分化，表达所有预期的特征标记。表明植入的DPSCs能够在缺损区微环境中存活，并通过类似软骨内骨化过程直接参与修复，但不排除DPSCs旁分泌作用的影响。DPSCs在治疗骨质疏松症方面的研究也有了新的进展，Kong等[13]将肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）基因和荧光素酶基因修饰的DPSCs导入去卵巢的小鼠体内，发现DPSCs可以存活1个月以上，大多数的DPSCs都分布在肺和肝脏，仅有少部分存于骨骼。DPSCs或DPSCs-HGF移植可明显减少去卵巢所致的股骨远端干骺端松质骨丢失，且DPSCs-HGF具有更强的缓解骨丢失的能力。提示DPSCs-HGF系统灌注治疗去卵巢所致骨丢失是一种潜在的治疗方法，其猜测这可能与旁分泌机制有关。

2.3 含DPSCs注射式凝胶及DPSCs膜片技术 除了目前常用的支架材料，如羟基磷灰石、β-磷酸三钙、胶原海绵等，注射凝胶和无支架的DPSCs膜片技术也受到学者们的关注。Hu等[14]比较了在猪牙周炎骨缺损模型中直接注射DPSCs和植入DPSCs膜片两种方法促进骨再生效果的差异，术后12周检测发现两种方法均能有效促进骨再生，而膜片植入组的新生骨量明显大于注射组。为探究载有MSCs的水凝胶在体内成骨的能力，Jang等[15]将混入DPSCs的共聚物溶液注射进小鼠的背部皮下，溶液在体内立即形成水凝胶。6周后取出水凝胶，经Micro-CT扫描、基因表达检测和组织学染色，发现DPSCs在体内的水凝胶中的分化为成骨细胞，提示了这种方法或许可以作为一种侵入性小的骨组织再生手段。此外Xia等[16]也探究了一种可注射型支架上DPSCs的增殖、成骨分化以及骨基质矿化形成的能力，发现在复合了纳米氧化铁的磷酸钙水门汀支架上DPSCs的碱性磷酸酶活性和成骨基因表达比在单独的磷酸钙水门汀支架要高出2～3倍。并且纳米氧化铁还能提升干细胞附着条件，具有良好的应用前景。有些学者还研究了无支架的DPSCs膜片移植技术，Fujii等[17]将用某种向日葵黄质衍生物（helioxanthin derivative，HD）处理过的DPSCs膜片移植到小鼠顱骨缺损区，8周后影像学观察发现移植区有明显的骨再生，并且再生量要比DPSCs的骨成型蛋白处理组要多。该研究团队后来又将标记有PKH26的向日葵黄质衍生物处理的DPSCs膜片移植到小鼠胫骨骨折中，14 d后取出骨折部位的骨组织进行免疫荧光染色发现DPSCs膜片定植于骨折区域，并促进骨形成，表示无支架DPSCs膜片技术可作为DPSCs应用于骨再生的一种选择[18]。

2.4 DPSCs胞外囊泡的成骨能力 MSCs来源的胞外囊泡具有组织修复和抗炎的特性，Imanishi等[19]探究了DPSCs的胞外囊泡在骨再生中发挥的作用，提取了DPSCs的胞外囊泡并将之与胶原结合注入小鼠颅骨缺损区，设对照组为载有DPSCs的胶原组，4周后取出植入区的骨块发现实验组和对照组产生的骨量相似，提示DPSCs的胞外囊泡或许也可以作为骨组织再生的一种有效的手段。

大量的动物实验已经证实了牙髓干细胞体内促进骨再生的良好应用前景，并且牙髓干细胞体内应用方式也受到学者们的广泛关注，但是要构建最佳的DPSCs成骨分化微环境以最大化发挥其促进骨再生能力则还需要进一步的研究[20]。

3 临床试验

除动物实验之外，近些年也有部分DPSCs成骨研究的临床试验的报道，大多数试验都是探索DPSCs在人体各部位应用的有效性。Barbier等[21]将从患者第三磨牙中提取出的DPSCs与胶原混合植入拔牙窝，6个月后发现加DPSCs的植入组在新生骨密度和根尖骨隔的高度变化上与单独植入胶原组无明显差异，这与当初部分学者的类似试验得出的结果相反[22]。最近也有学者将DPSCs和胶原海绵植入牙周炎的骨缺损区，经过6个月和12个月的复查，发现与仅植入海绵组相比，实验组有着更大程度的骨再生，并且探诊深度和附着水平获得更显著的改善[23]。此外，还有学者将牙髓干细胞和HA-胶原海绵支架植入腭裂患者的牙槽骨裂区，用于关闭裂隙，试验设对照组一（骨成型蛋白-2处理组）和组二（髂骨移植组）。结果表明，6个月后DPSCs组和组二新生骨量相似，明显高于组一。此外，关于术后并发症，组一术后肿胀发生率为37.5%，组二供区疼痛发生率为87.5%，而DPSCs组未发现并发症[24]。Hernández等[25]选取了22例帕金森病老年患者，将其分为实验组和对照组，将载有DPSCs的胶原植入实验组牙周骨缺损区域，而对照物则无DPSCs植入，并在术前和术后6个月采集受试者唾液标本，测定抗氧化剂、超氧化物歧化酶、过氧化脂质和白细胞介素的总浓度。6个月后，影像学检查发现实验组的植入区骨密度要高于对照组，并且与对照组相比，实验组超氧化物歧化酶水平显著更高而IL-1β水平则较低，其推测DPSCs改善受试者骨密度可能与升高超氧化物歧化酶和降低IL-1β水平有关。

虽然绝大多数临床试验表明DPSCs在人体内许多部位均能发挥良好的效果，但目前与DPSCs成骨相关的临床试验仍然较少，牙髓干细胞治疗的应用方向和具体的应用方式方法的确立还需要未来更多的临床试验来奠定基础。

4 炎症牙髓干细胞及同种异体牙髓干细胞

一些学者还探究了来源于炎症牙髓的DPSCs成骨特性。Li等[26]提取了2例牙髓炎患者的牙髓干细胞并将其与β-TCP混合植入患者牙周骨缺损处，9个月后植骨区域显示良好的骨再生，其将炎症牙髓的牙髓干细胞和正常的牙髓干细胞比较发现，虽然细胞原代培养成功率和生长状态受到一定程度影响，但炎症牙髓干细胞仍表达了健康牙髓来源干细胞的标志物，并保持了其多向分化能力。Xue等[27]用辛伐他汀处理炎症牙髓干细胞后，发现低剂量的辛伐他汀可以促进炎症牙髓干细胞的增殖能力，并降低其炎症反应、调节血管内皮因子的生成。Li等[28]比较了单独使用β-TCP、联用β-TCP和猪炎症牙髓干细胞以及联用β-TCP和猪正常的牙髓干细胞对猪牙周骨缺损的影响，影像学显示，牙髓干细胞组骨组织增量更显著。并且正常的牙髓干细胞的成骨效果要强于炎症牙髓干細胞，有着更强的骨保护素表达。对于这类牙髓干细胞的评价，目前大多数学者认为其具备某些情况下替代正常DPSCs的潜力，但仍需要进一步研究来明确其特性。

由于牙髓干细胞免疫原性较低，且有着良好的免疫调节作用，有学者采用异体的未经人类白细胞抗原配型的SHED联合海绵支架植入拔牙窝的报道，6个月后临床检查和影像学显示骨再生良好，且未出现安全方面问题[29]。除了牙髓来源的干细胞外，还有许多其他来源的同种异体间充质干细胞的细胞移植临床试验，绝大多数都未出现不良反应，然而异体MSCs的临床应用依然存在很多伦理和安全方面的问题，还有待进一步的探究。

5 展望

牙髓干细胞近些年来受到学者们的广泛关注，大量实验已经证实了其组织再生能力，但是MSCs移植的生物安全性（遗传不稳定性、致瘤性等）及其发生机制还值得进一步探索。临床试验和治疗应当严格按照干细胞应用相关质控标准进行，最大化降低干细胞应用风险。目前有关牙髓干细胞促进骨再生的研究中，体外实验和动物实验较多，但临床试验较少，未来需要更多的临床试验来证明其临床应用的优势。此外，目前的研究对于牙髓干细胞的加工方法、移植方法（包括支架选择和细胞移植数量）以及细胞移植安全性评判尚缺乏同一的标准，需要制订一套应用标准来最大化提升其疗效和应用安全性。

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（收稿日期：2021-09-23） （本文编辑：占匯娟）