泛素连接酶三基序蛋白21对结直肠癌鞘氨醇激酶2的调控作用及其机制

肖明超 孟昭源 赵姣姣 方文硕 蔺吉春 马蕾娜

(1 青岛大学基础医学院，山东 青岛 266071; 2 青岛大学附属医院肿瘤研究所)

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人类健康[1]。CRC的重要特征之一是细胞中鞘脂代谢的失调[2]。已有研究表明鞘氨醇激酶2(SphK2)在CRC细胞中异常高表达将打破鞘脂代谢平衡，促进CRC细胞的增殖、迁移以及化学治疗耐药的发生[3-4]。因此，探讨SphK2在CRC中的调控以及修饰机制或能为CRC的治疗提供更好的策略。尽管SphK2在CRC细胞中的重要功能已被证实，但CRC中SphK2高表达的原因及其上游的调控蛋白尚未完全阐明。泛素化修饰作为重要的翻译后修饰方式之一，通过调控底物蛋白的稳定性、活性或细胞定位而参与调节重要的细胞过程，与癌症发生发展密切相关[5-8]。然而，在CRC中SphK2的泛素化修饰机制并不清楚。三基序蛋白21(TRIM21)是细胞中的一种泛素连接酶，在泛素化修饰过程中起关键的催化作用，能直接决定泛素化修饰的特异性及底物蛋白命运，可能是结直肠癌治疗的潜在靶点。因此，本研究旨在探讨CRC中泛素连接酶TRIM21对SphK2的调控作用及其机制，为CRC的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞系和主要试剂

HEK-293T细胞系、PLC/RPF/5细胞系、RKO细胞系均来源于中国科学院上海细胞库。CCK-8试剂盒(大连美仑生物技术公司)，体外泛素化检测试剂盒(优碧生物公司)，SphK2抗体(武汉Proteintech公司)，Ubquitin抗体、β-Actin抗体(美国CST公司)，TRIM21抗体(武汉爱博泰克公司)，Vinculin抗体、琼脂糖珠(美国Sigma公司)，谷胱甘肽琼脂糖珠(美国GE Healthcare公司)，HA-TRIM21质粒、Flag-SK2质粒、His-TRIM21质粒(本课题组实验室前期构建)、GST-SphK2质粒，psPAX2质粒、PMD2.G质粒、sgTRIM21质粒均购自于Addgene: Homepage网站。

1.2 研究方法

1.2.1细胞培养以及处理 将HEK-293T细胞、PLC/RPF/5细胞、RKO细胞均接种于含体积分数0.10的FBS、体积分数0.01的青霉素-链霉素混合液的细胞培养基中，置于37 ℃、含体积分数0.05的CO2培养箱内培养。待细胞处于对数生长期时，使用胰酶消化传代或参照聚乙烯亚胺说明书对细胞进行转染。

1.2.2采用质谱与免疫共沉淀方法鉴定SphK2与TRIM21的相互作用情况 将转染Flag-SphK2后的PLC/RPF/5细胞分为a、b、c、d、e组，分别采用表皮生长因子刺激、葡萄糖饥饿处理、过氧化氢刺激、缺氧处理、转化生长因子-β刺激。转染48 h后，将细胞裂解并行SDS-PAGE电泳，切取SphK2所在的蛋白凝胶作为质谱样品送至上海中科新生命生物科技有限公司进行质谱分析。另外将处于对数生长期的HEK-293T细胞分为f、g组，分别转染Flag-SphK2、Flag-SphK2+HA-TRIM21质粒。当转染36 h后，加入10 μmol/L MG132处理细胞12 h。制备细胞裂解液，向裂解液中分别加入HA、Flag抗体偶联的琼脂糖珠，参照文献报道的方法[9]进行免疫共沉淀实验检测TRIM21与SphK2的相互作用情况。

1.2.3采用体内泛素化实验鉴定TRIM21介导的SphK2泛素化 将处于对数生长期HEK-293T细胞分为h、i、j、k组，分别转染Flag-SphK2、Flag-SphK2+His-Ubquitin、Flag-SphK2+His-Ubquitin+1 μg HA-TRIM21质粒以及Flag-SphK2+His-Ubquitin+4 μg HA-TRIM21质粒。转染36 h后，加入10 μmol/L MG132处理12 h，参照文献报道的方法[10]进行His-Ubquitin pull-down实验检测SphK2的泛素化水平。

1.2.4采用蛋白质体外结合实验来鉴定SphK2与TRIM21的相互作用情况 将His-TRIM21、GST-SphK2质粒转化BL21感受态大肠杆菌，参照蛋白质纯化手册制备纯化的His-TRIM21、GST-SphK2蛋白。之后将两蛋白混合，将混合液分为p、q组，分别加入琼脂糖珠以及谷胱甘肽琼脂糖珠，参照相关文献报道的方法[11]来进行蛋白体外结合实验检测TRIM21与SphK2蛋白相互作用的情况。

1.2.5采用体外泛素化实验鉴定TRIM21介导的SphK2泛素化 将EP管分为r、s、t三组，每组分别加入GST-SphK2+E1/E2/Ub、GST-SphK2+His-TRIM21、GST-SphK2+His-TRIM21+E1/E2/Ub蛋白。参照体外泛素化试剂盒说明书制备免疫印迹(Western-blot)样品，检测TRIM21对SphK2泛素化水平的影响。

1.2.6TRIM21敲除对RKO细胞中SphK2蛋白水平以及蛋白半衰期的影响 参照文献中报道的方法[12]生产并收集慢病毒。将处于对数生长期的RKO细胞分为u、v、w、x四组，分别感染慢病毒LV-sgTRIM21-1、LV-sgTRIM21-2、LV-sgTRIM21-3以及LV-sgControl，以获得TRIM21敲除的RKO细胞系。通过Western-blot实验检测u～x组细胞中SphK2蛋白水平的变化。之后向u～x组的细胞中分别加入终浓度为20 mg/L的放线菌酮CHX，在加药后的0、12、24 h收集细胞并对其进行Western-blot实验，以用于检测TRIM21敲除对细胞中SphK2半衰期的影响。

1.2.7TRIM21过表达对HEK-293T细胞SphK2蛋白水平的影响 将处于对数生长期的HEK-293T细胞分为l、m、n、o组，分别转染HA-TRIM21质粒0、0.3、0.6、0.9 μg，进行Western-blot实验检测TRIM21外源过表达对SphK2蛋白水平的影响。使用Image J软件分析蛋白条带灰度值，目的蛋白相对表达量以目的蛋白灰度值/内参照蛋白灰度值计算，结果取3次重复实验的均值。

1.2.8TRIM21对RKO细胞5-氟尿嘧啶(5-FU)敏感性的影响将处于对数生长期的u～x组RKO细胞消化接种于96孔板中，设置7个浓度梯度组，待细胞贴壁后每孔中加入含不同浓度(0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 μmol/L)5-FU的培养基100 μL，继续培养48、72、96 h后，向各孔中分别加入10 μL的CCK-8检测液，并在37 ℃下孵育2 h，最后用酶标仪检测波长450 nm处各孔的吸光度值，并计算细胞存活率。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 SphK2与TRIM21蛋白相互作用情况

图1A、B分别为质谱样品的考马斯亮蓝染色、Western-blot实验检测结果，其结果显示TRIM21、HECTD2、RBBP6、BRE1B、LNX1、HuWE1、DTX3、RNF113A在内的8种泛素连接酶和2种去泛素酶USP15、OTU1均可能与SphK2存在着相互作用。其中，除TRIM21检测到的肽段数值为17以外，其他7种泛素连接酶的肽段数值均为1，该值越高代表蛋白质的可信度越高。因此进行蛋白质免疫共沉淀、蛋白质体外结合实验证实TRIM21与SphK2间存在相互作用。其中，蛋白质免疫共沉淀实验的结果如图1C、D所示，与f组相比，g组能够检测到对应的SphK2及TRIM21条带，证明SphK2与TRIM21之间可以发生相互作用。蛋白质体外结合实验结果如图1E所示，与p组相比较，q组能检测到对应的TRIM21条带，也进一步证实TRIM21与SphK2存在相互作用。

A和B：质谱鉴定SphK2与TRIM21的相互作用情况，C和D：验证SphK2与TRIM21蛋白在体内的相互作用情况，E:验证GST-SphK2与His-TRIM21蛋白在体外的相互作用情况

2.2 TRIM21对SphK2泛素化水平的调控作用

体内泛素化实验结果如图2A所示，与h、i组相比，j、k组HEK-293T细胞中SphK2泛素化水平随TRIM21转染量的增加而提高，证明TRIM21可以介导SphK2发生泛素化。体外泛素化实验结果如图2B所示，与r、s组相比，t组检测到了SphK2泛素化条带，进一步证实TRIM21能够介导SphK2的泛素化修饰。

2.3 TRIM21对SphK2蛋白表达水平的影响

TRIM21外源过表达实验结果如图3A所示，l～o组细胞中SphK2蛋白的相对表达量分别为0.23±0.02、0.84±0.08、1.56±0.12、1.72±0.10，与l组比较，m～o组SphK2蛋白相对表达量明显增高(F=196.22，P<0.05)。基因敲除实验结果如图3B所示，x、u、v组细胞中SphK2蛋白相对表达量分别为1.44±0.14、0.37±0.18、0.45±0.19，与x组比较，u、v组细胞中SphK2蛋白的相对表达水平明显降低(F=37.30，P<0.05)。半衰期实验结果如图3C所示，u组SphK2蛋白降解速率高于x组。

A、B分别为体内、体外泛素化实验验证TRIM21对SphK2泛素化水平的调控作用

A为HEK-293T细胞过表达TRIM21对SphK2蛋白表达水平的影响，B、C分别为RKO细胞中敲除TRIM21对SphK2蛋白表达水平、蛋白半衰期的影响

2.4 5-Fu不同作用时间对敲除TRIM21的RKO细胞存活率的影响

重复测量设计方差分析结果显示，时间、组别、时间与组别交互作用对细胞存活率均有明显的影响(F组别=365.67，F时间=251.95，F时间*组别=16.73，P<0.05)。单独效应分析结果显示，在5-Fu处理细胞48、72、96 h后，与x组相比，u～w组细胞的存活率明显降低(F=24.83～890.51，P<0.05)；并且随着5-Fu作用时间的增长，u～x四组细胞的存活率显著降低(F=30.42～92.13，P<0.05)。见表1。

表1 5-Fu不同作用时间对敲除TRIM21的RKO细胞存活率的影响

3 讨 论

在世界范围内，CRC患者的发病率和死亡率均居前列[13]。据世界卫生组织国际癌症研究机构公布，我国2020年CRC新发病例56万，排名超过胃癌跃居第2位[14]。且随着生活水平的提高和人口老龄化的加剧，CRC的发病率还将不断提高。CRC患者迫切需要高效的治疗方案。尽管手术、放化疗是长期以来结直肠癌治疗的常用策略，但疗效并不理想，有待进一步完善。

随着脂质代谢组学研究的不断深入，人们认识到CRC的特征之一是鞘脂代谢的失调[2,15]。鞘脂代谢的产物主要包括神经酰胺(Cer)、鞘氨醇(Sph)和鞘氨醇-1-磷酸(S1P)，它们均可以作为信号分子参与级联反应进而调控细胞内的多种关键过程。其中，Cer和Sph可以抑制细胞增殖、促进细胞凋亡,然而与之相反的是S1P可以促进细胞存活以及增殖[16-18]。正常情况下，这3种信号分子在细胞内处于复杂的动态平衡中：Cer可以被水解生成Sph，而Sph则可以通过鞘氨醇激酶SphK磷酸化生成S1P[19-21]。它们之间的转化决定着细胞的命运是走向凋亡还是走向增殖。Sphk是这个过程最关键的调控酶之一，它包含两种亚型：SphK1和SphK2。虽然两种酶高度同源且催化相同的反应，但是它们在亚细胞定位、组织分布等方面并不相同。其中，SphK2在结直肠癌中起到重要的作用，具体表现为：一方面，SphK2在CRC中表现为异常的高表达，这种高表达促进了CRC细胞的增殖、迁移[3]；另一方面，SphK2的高表达可以降低多种CRC化疗药物的抗癌作用[22]，包括全反式维甲酸(ATRA)、丁酸钠(SB)及一线化疗药物5-Fu，而下调SphK2的表达水平可以增强CRC细胞对这些化疗药物的敏感性[4,19-20]，提示SphK2可能是CRC治疗的靶点。尽管结直肠癌中SphK2的重要功能已被证实，但结直肠癌中SphK2高表达的原因及其上游的调控蛋白尚未完全阐明。

本研究首先通过质谱分析、免疫共沉淀及蛋白质体外结合实验确认了泛素连接酶TRIM21与SphK2蛋白间的相互作用。为探究这种相互作用的具体机制，本研究进行了体内及体外泛素化实验，证实TRIM21可以介导SphK2的泛素化修饰。随后，为探索TRIM21介导的SphK2泛素化修饰对SphK2蛋白水平的影响，本研究构建了TRIM21敲除的RKO细胞系，通过Western-blot和半衰期实验，证明了TRIM21介导的SphK2泛素化修饰能够稳定SphK2蛋白水平。考虑到有文献报道SphK2的高表达能提高结直肠癌细胞对5-Fu的耐药性，所以我们推测，敲除TRIM21或许能够逆转结直肠癌细胞对5-Fu的耐药。本研究通过CCK-8实验对这一猜想进行了验证，发现在5-Fu处理的情况下，TRIM21敲除的RKO细胞存活率显著低于x组细胞，即TRIM21的敲除提高了RKO细胞对5-Fu的敏感性。

本研究不仅是对SphK2修饰机制在理论上的完善，还对于临床治疗具有参考意义：①提示抑制TRIM21或许能够作为CRC治疗的新策略。由于SphK2对一些肿瘤具有致癌的效应[23-26]，目前已有SphK2抑制剂相关的研究，然而SphK2抑制剂效价低、特异性低，限制了其在临床治疗的应用[22,27]。而本研究发现TRIM21能稳定SphK2蛋白水平，提示可以去开发TRIM21的抑制剂用于CRC单独治疗，或联合SphK2抑制剂进行CRC的治疗。②提示可以通过抑制TRIM21解决由SphK2高表达导致的5-Fu、ATRA、SB的耐药问题。耐药的产生是化疗的主要障碍之一，通过抑制TRIM21解决这些药物的耐药是一种全新的策略。③提示在CRC中TRIM21可能是预测患者预后的一项指标。

综上所述，本研究证实了CRC中TRIM21通过与SphK2发生相互作用，催化SphK2发生泛素化，这种泛素化稳定了SphK2蛋白性能。而敲除TRIM21的CRC细胞的SphK2蛋白水平显著下降，并且对5-FU敏感性也增加。本研究揭示了TRIM21在CRC细胞中对SphK2的调控作用，并提出了一种解决CRC细胞5-FU耐药的潜在方案，为CRC治疗策略的完善提供了新的支持。