柿单宁酶PsnTanA 异源表达及酶学特性表征

卢海强，陈 伟，田洪涛，谷新晰，谷子林

（1.河北农业大学 食品科技学院，河北 保定 071000；2.河北农业大学 动物科技学院，河北 保定 071000）

单宁酶(EC 3.1.1.20)是一类能够水解单宁酯键和缩酚酸键酶的总称［1］，广泛分布在植物，动物和微生物中［2-3］。目前，单宁酶已表现出了巨大应用价值，如茶经单宁酶处理后，可有效控制“茶乳”的形成，增强茶的口感和风味［3-4］。单宁酶可以提升果汁的澄清度，降低果汁的苦涩及增强果汁的生物活性等效果［6］。除此之外，单宁酶在饲料和废水处理也有着巨大应用［7-8］。目前商品化的单宁酶主要来自曲霉，如黑曲霉［9］和米曲霉［10］等。然而，这些单宁酶也存在一些不足，如较差的缩合单宁降解效率及较高的温度敏感性，这些因素限制了单宁酶的应用领域。

随着基因工程技术的发展，目前重组菌构建越来越受到关注，单宁酶重组菌也越来越多，如Kanpiengjai 等人从乳酸菌中克隆了碱性单宁酶基因并在大肠杆菌BL21(DE3)中重组表达［11］；Kumar等人从肺炎克雷伯菌中克隆了单宁酶基因并在大肠杆菌BL21(DE3)中重组表达［12］。然而，目前只有少数单宁酶得到了详细的表征和商业化应用，远远不能满足单宁酶相关研究和应用的需要。2020 年Dai等人首次从植物体内发现了单宁酶［13］，丰富了现有单宁酶资源，而该单宁酶的相关性质尚未见报道。

本研究拟依据大肠杆菌密码子偏好性，优化并合成柿树单宁酶基因；在大肠杆菌表达系统进行单宁酶生产，利用Ni-NTA 亲和层析对产物进行分离纯化，并对重组单宁酶PsnTanA 进行酶学性质表征，为柿树单宁酶PsnTanA 的理论和应用研究提供一定的指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大肠杆菌（Escherichia coli）BL21(DE3) 由本课题组保存；PCR 反应试剂购自大连宝生物有限公司，硫酸卡那霉素（Kan），琼脂糖凝胶回收试剂盒，质粒提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；蛋白标准分子量Marker 购自河北瑞帕特生物科技有限公司；罗丹宁，没食子酸正丙酯购自上海源叶生物科技有限公司；Ni-NTA 购自上海碧云天生物技术有限公司，其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

酶标仪 Bio-RAD；SDS-PAGE 电泳设备 北京君意东方电泳设备有限公司。立式高速低温离心机HITACHI 公司；JY88-IIN 超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 柿树单宁酶密码子优化及基因合成 使用GenSmart™ Codon Optimization 工具（https://www.genscript.com/）对柿树单宁酶基因（MK381274.1）进行稀有密码子分析及优化，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成并连接至pET30a 表达载体。

1.3.2 生物信息分析 采用SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/interactive）软件对单宁酶PsnTanA 进行同源建模，并利用Pymol 软件进行可视化分析。使用 Vector NTI 11.0 软件计算单宁酶PsnTanA 的基本参数。

1.3.3 重组菌的构建与诱导表达 表达质粒经热激转化至E. coilBL21(DE3)感受态细胞，随后挑取单菌落接种于LB 液体培养基中振荡培养，当发酵菌液OD600达到0.6 左右时添加IPTG 试剂的进行诱导。诱导培养结束后，取培养液，8 000 r/min 条件下离心10 min，收集细胞沉淀，并用PB 缓冲液（0.2 mol/L，pH 7.0）重悬后超声破碎，超声条件为：超声5 s，间歇6 s，超声功率0.3 kW，20 次。细胞破碎液离心后收集上清，即为粗酶液样品。

1.3.4 重组单宁酶的纯化及SDS-PAGE 分析 采用Ni-NTA亲和层析方法进行重组酶PsnTanA的纯化。将粗酶液注入平衡好的Ni 柱，用9 mL PB 缓冲液分3 次加入洗涤杂蛋白，分别用3 mL 含20，40，80，100，200 和300 mmol/L 咪唑的洗脱液进行洗脱处理，收集各部分洗脱液，测定单宁酶酶活性。利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）检测各组分的纯化效果。采用Bradford 方法测定蛋白质浓度。

1.3.5 单宁酶酶活力的测定 参考Sharma 等［14］的方法进行单宁酶活性的测定：取适当稀释酶液（100 μL）与没食子酸丙酯溶液（400 μL，1.25 mmol/L，pH 6.0） 混 匀，30 ℃反 应10 min 后 加 入300 μL罗丹宁甲醇溶液（50 mmol/L）终止反应，加入溶液KOH（200 μL，0.5 mol/L）进行显色，随后在520 nm 波长处测定吸光度。定义每分钟生成1 μmol没食子酸所需的酶量为1 个酶活力单位（U）。

1.3.6 温度和pH 对重组单宁酶活性的影响 以没食子酸正丙酯为底物，在0 ～80 ℃的温度的条件下测定重组酶PsnTanA 活性变化规律；在40 ℃或50℃条件下处理0、5、10、20、30 和60 min 后，测定重组单宁酶活性变化规律；将重组酶PsnTanA 在pH 2.0 ～12.0 条件下测定重组酶PsnTanA 活性变化规律；在不同pH 2.0 ～12.0 缓冲液中，0 ℃保温1 h 后测定重组酶PsnTanA 活性变化规律。

1.3.7 金属离子及化学试剂对重组单宁酶活性的影响 在酶反应体系中分别加入不同金属离子或不同化学试剂，使其浓度分别为1 mmol/L 和5 mmol/L（或体积浓度1%和5%）进行反应，进行活性的测定。

1.3.8 重组单宁酶底物特异性及动力学常数的测定 参考上述活性测定方法，分析重组酶PsnTanA 对没食子酸甲酯（MG）、没食子酸乙酯（EG）、没食子酸正丙酯（PG）和表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）的底物的水解能力。称取1.0 g 茶（红茶、绿茶）或谷物（高粱、绿豆）研磨成粉末状，料水比（w/v）为1∶50，煮沸，冷却至适当温度，加入单宁酶（以U 为单位添加），在单宁酶的最适反应温度下反应1 h，煮沸5 min 灭酶活，测定没食子酸。在最适条件下，以PG（0.25 ～5 mmol/L）为反应底物，基于Lineweaver-Burk 方法计算重组单宁酶PsnTanA 的Km 和Vmax 值。

1.3.9 数据分析与统计 上述试验均重复3 次，并利用GraphPad Prism 8.0 软件对数据进行统计分析，数据结果采用平均值±标准误差表示。

2 结果与分析

2.1 单宁酶PsnTanA 的生物信息学分析

柿树单宁酶PsnTanA 的基因全长912 bp，编码303 个氨基酸和1 个终止密码子。经分析野生型柿树单宁酶基因中含有30 个大肠杆菌稀有密码子和5处连续稀有密码子（CCC CCC、GGA CCC、GGG AGG、ACG GGG 和AGA GGG）。优化后，该基因共有21 个稀有密码子进行了同义密码子的替换，并消除了连续稀有密码子。CAI（Codon Adaptation Index）值和GC 含量由此前的0.62 和60.20%分别改变为0.76 和57.11%，基因序列优化前后的一致性为78.3%。

经三维结构模拟分析可知（见图1），单宁酶PsnTanA 由2 个结构域组成，分别是α/β 水解酶折叠域和Lid 结构域。α/β 水解酶折叠核心域或由8 个β 折叠片和5 个α 螺旋组成，其中2 个α螺旋位于8 个β 折叠的凹侧(α2 和α17)，3 个位于凸面(α3、α4 和α12)。Lid 结构域则由2 个平行的β 折叠和1 个反平行的β 折叠组成。单宁酶PsnTanA 催化三联体残基为S164、D245 和H278，具有保守活性位点基序“G-X-S-X-G”，而与微生物来源单宁酶中普遍存在的“CS-D-HC”保守基序存在差异［15］。Dai 等人构建了柿树单宁酶G76A和G77A 突变体，发现突变体不再具有单宁酶活性，证明了Gly-Gly 氧阴离子洞在催化水解过程具有关键的作用［13］。Ser164 位于底物口袋底部特征性的“亲核肘”位置，处于β8-α4 的loop 结构顶部，这允许亲核氨基酸残基有效地呈递给底物，并将酶-底物中间体定位在氧阴离子洞的氢键距离内，从而使过渡态的稳定。

图1 柿单宁酶PsnTanA 的 三维结构模拟Fig. 1 The overall structure of tannase PsnTanA from persimmon

2.2 重组酶PsnTanA 的纯化及SDS-PAGE 分析

发酵液菌体经超声波破碎处理后，采用镍柱亲和层析方法进行重组蛋白的纯化。经测定，当洗脱液为40 mmol/L 咪唑时，收集到的单宁酶活性最高。经SDS-PAGE 分析（见图2），泳道1 为细胞破碎液上清，泳道2 为纯化的重组蛋白，表观分子量约为39 kD，其比酶活力为1.08 U/mg。本研究中，重组酶PsnTanA 采用融合表达His 标签策略进行异源表达，继而增大了酶蛋白分子量，类似的现象也有报道［16］。

图2 重组单宁酶PsnTanA 的SDS-PAGE 分析Fig. 2 The SDS-PAGE analysis of purified recombinant tannase PsnTanA

2.3 单宁酶PsnTanA 的酶学性质分析

2.3.1 温度和pH 对重酶活力的影响 如图3A 所示，单宁酶PsnTanA 在0 ～70 ℃范围内均表现出一定的活性，50 ℃时活性最高，在40 ～50 ℃的温度范围酶活力维持在76.9%，随着反应温度的增加，重组单宁酶活性急剧下降，70 ℃仅残留10%左右的酶活力。重组酶PsnTanA 在40 ℃温度条件下处理60 min 后，酶活力仍保持80.0%以上，该酶表现出较好的温度稳定性；随着处理温度的提升，酶的温度耐受性随之减弱，如在50 ℃温度条件下处理60 min后，酶活力保持在10.0%左右（图3D）。

由 图3B 可 知， 重 组 酶PsnTanA 在pH2.0 ～12.0 范围内均表现出活性，pH 7.0 反应条件下，PsnTanA 的酶活力最大，而pH8.0 条件下，PsnTanA的酶活力降至20.3%。经重组酶PsnTanA 的pH 稳定性测定结果（图3C）可知，该酶在pH6 ～12 之间具有较好的稳定性，残余酶活力大于60%，在酸性条件下，重组酶的稳定性较差。

图3 重组单宁酶PsnTanA 的酶学特性Fig. 3 Enzymatic properties of the recombinant tannase PsnTanA

2.3.2 金属离子和化学试剂对酶活力的影响 经测定低浓度（1 mmol/L）的Ca2+对PsnTanA 无抑制作用，Na+、K+、Li+及Mg2+在1 和5 mmol/L 的浓度下，对PsnTanA 酶活力有轻度抑制作用，残余酶活力保持在70% 以上。Al3+对PsnTanA 酶活力有中度抑制作用，重金属离子Ag+、Mn2+、Zn2+、Cu2+和Fe3+对PsnTanA 酶活力有重度抑制作用。在5 mmol/L 的浓度下Ag+、Zn2+、Cu2+和Fe3+可使PsnTanA 酶活力丧失90%以上，其中Cu2+几乎完全抑制PsnTanA 的酶活力（见表1）。

表1 金属离子和化学试剂对单宁酶PsnTanA 的影响Table 1 Effect of metal ions and chemical reagents on the activity of tannase PsnTanA

化学试剂对重组酶PsnTanA 均表现出不同程度的抑制作用，并且多数试剂添加量越大抑制作用越强，只有尿素在高浓度下抑制作用反而减弱。螯合剂EDTA 抑制了PsnTanA 约35% 的酶活力；表面活性剂SDS、吐温80 和CTAB 的抑制作用最强，几乎完全抑制了PsnTanA 的酶活力；5%的甲醇、乙醇、异丙醇及丙酮可抑制90%以上的酶活力。

2.4 单宁酶PsnTanA 的底物谱和动力学参数

经测定，单宁酶PsnTanA 随着底物酯链的增加而活性降低，且该酶对合成底物（MG、EG 和PG）表现出比天然底物（EGCG）更高的活性。以PG 为底物，重组酶PsnTanA 的Km 值和Vmax 值分别为1.71 mmol/L 和2.56 mmol/（L·min）。本研究进一步测定了该酶在绿茶、红茶、高粱及绿豆中的降解能力（图4）。重组酶PsnTanA 可有效降解绿茶中的单宁物质，使得单宁酸的含量提高了40%左右（绿茶含7.5 μg/mL），然而类似的现象并未在红茶的酶解中发现。除此之外，该酶对高粱中的单宁有表现出了高效的降解，使得没食子酸含量增加了42.2 μg/mL。同样，重组酶对绿豆中的单宁也显示出了较好的降解能力。

图4 重组单宁酶PsnTanA 的底物特异性Fig. 4 The substrate specificity of the recombinant tannase PsnTanA

3 结论与讨论

柿树与大肠杆菌的遗传密码子使用频率存在较大差异，因此，参照大肠杆菌的密码子偏好性优化PsnTanA 的野生型基因，替换了21 个大肠杆菌稀有密码子，改善了密码子偏性状况，CAI 值由0.62 提高至0.76，更接近于理想值1.0［17］，这为该酶的成功表达提供了保障。

重组酶PsnTanA 最适反应温度为50 ℃，在40 ～55 ℃反应时，该酶可表现出约80 % 以上的酶活力，当温度大于60 ℃后，酶活力急剧下降。Kanpiengai 等人报道的戊糖乳杆菌单宁酶LpTanBA-7 的最适反应温度同样为50 ℃，LpTanBA-7 在50 ℃下酶活力半衰期为30 min。重组酶PsnTanA 在50 ℃温条件下处理10 min 后，酶活力保持在49.0%，在40 ℃温度条件下处理60 min后，仍保持80.0%的酶活力。pH 值影响活性位点氨基酸残基的质子化和去质子化，而影响酶的催化效率和稳定性［18］。多数真菌单宁酶在酸性环境中有较高酶活力，最适pH 值在pH 4.5 ～6.0 的范围内［19］；而大多数细菌来源的单宁酶则在pH 值7.0 ～8.0 的范围内具有较高酶活力［20］。鲁顿葡萄球菌单宁酶pH 值为7.0，同重组单宁酶PsnTanA 一样在酸性环境中酶活力较低，但经过固定化后鲁顿葡萄球菌单宁酶酶活力提高了35%［21］。酶经固定化材料包埋后，固定化酶在液体环境中的暴露减小，溶液中pH的变化对固定化酶活性的影响较小。因此，单宁酶PsnTanA 的固定化应是提高该酶特性的策略之一。

金属离子和化学试剂对重组酶PsnTanA 的酶活力均表现出不同程度的抑制，其中金属离子的抑制作用尤为显著，如Cu2+和Fe3+几乎完全使PsnTanA活性丧失。类似的现象在黄蕾等［22］、Kanpiengjai等等人研究中均有发现［11］。推测这很可能是由于金属离子与酶活性部位的巯基、色氨酸残基和或羧基相结合，继而阻碍了酶与底物结合而生成产物。

本研究实现了柿树单宁酶PsnTanA 在大肠杆菌中的异源表达，重组酶 PsnTanA 最适反应温度和最适pH 分别为50 ℃和7.0 ，该酶对高粱中的单宁有较好的降解效果，本研究有利于柿树单宁酶PsnTanA 理论和应用研究的进一步开展。