花生TCP 家族基因鉴定及其在侧枝发育中的表达分析

张靖男，韦丽君，陈娟娟，杨鑫雷，穆国俊，侯名语，崔顺立，刘立峰

（河北农业大学 华北作物改良与调控国家重点实验室/华北作物种质资源教育部重点实验室/河北省种质资源实验室，河北 保定 071001）

花生是世界重要的油料作物之一，同时也是人类重要的优质植物油脂和蛋白质来源。目前，有关花生转录因子家族的鉴定与分析已有一些进展，如bHLH［1］、WRKY［2］、bZIP［3］等，其中与bHLH家族蛋白具有相似DNA 结构域的转录因子家族——TCP 转录因子［4］，则在花生中鲜见报道。TCP 是由玉米的Teosinte branched1（TB1）、金鱼草的Cycloidea（CYC）和水稻的Proliferating cell factors（PCF1 和PCF2）4 个基因的首字母组合而成［5］。其中，TB1 基因与植物的顶端优势有关，CYC 基因对花序的对称结构有重要作用，PCF 则与水稻PCAN 基因的启动子结合相关［6］。前人研究表明，TCP 转录因子广泛参与植物激素合成和信号转导［7］、形态建成［8］和逆境胁迫应答［9］。TCP 基因家族已在拟南芥（24 个）和水稻（21 个）［10］、玉米（43 个）［11］、大 豆（54 个）［12］、陆 地 棉（74个）［13］等作物中被鉴定，且部分基因的分子功能已清楚。如拟南芥AtTCP1 基因通过调节DWF4 的表达来调节BR 的生物合成［14］；AtTCP20 能够调控叶片的衰老［15］；水稻OsPCF7 基因能够调控水 稻 株 高 及 分 蘖［16］；玉 米GRMZM2G120151、GRMZM2G148022和GRMZM2G089361可能参与调控分生组织细胞分裂周期，从而影响器官发育［17］；TCP 家族基因可能影响大豆的花序形态建成及侧枝数［18］；陆地棉GhTCP14在纤维伸长期的细胞中表达量受外源生长素上调表达［19］。鉴于此，本研究通过侧枝发育转录组测序及生物信息学方法，对花生TCP 家族基因进行全基因组鉴定、理化性质分析、保守结构域分析、系统进化分析及在侧枝发育的不同时期的转录表达分析，为进一步研究花生TCP 转录因子的功能及其调控机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料花生品种‘冀花5 号’（直立型）和‘M130’（匍匐型）由河北农业大学花生育种组提供，种植于河北农业大学创新实践园，催芽盆栽。待2品种的第1 对侧枝长出后的5、10、15、20、25、30 d，每个时期分别取3 株混样（3 次生物学重复）样品（每份样品由3 株混样），液氮速冻，存放于-80 ℃冰箱，送至北京百迈客生物科技有限公司进行转录组测序。

1.2 方法

1.2.1 花生TCP 基因家族鉴定 从Peanutbase 网站下载四倍体花生和野生二倍体花生基因组蛋白序列；同时，从Pfam 数据库下载隐马尔可夫模型文件（PF03634），通过在线工具HMMER（https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/）进行TCP 蛋白序列搜索，并在Pfam 数据库中进行序列比对和确认。

1.2.2 花生TCP 家族基因生物信息学分析 依据各成员在花生基因组中的物理位置，依次命名［20］；通 过TAIR（https://www.arabidopsis.org/） 下 载 拟南芥TCP 家族成员，采用MEGA-X（https://www.megasoftware.net/）进行花生和拟南芥TCP 家族成员的多序列比对，邻接法构建系统进化树；利用MEME（http://meme-suite.org/tools/meme）在线预测保守基序；采用GSDS 2.0［21］绘制基因结构图；通过Expasy (http://www.expasy.org/tools/protparam)在线网站对各成员的氨基酸数量、分子量大小、等电点等理化性质进行预测；利用Cello（http://cello.life.nctu.edu.tw/）进行亚细胞定位预测；通过PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在线预测各基因启动子区顺式作用元件，采用GSDS2.0 绘制顺式作用元件图。

1.2.3 花生TCP 家族基因表达分析 以‘冀花5 号’和‘M130’第1 对侧枝不同生长时期的转录测序FPKM 值作为基因表达衡量标准进行表达分析。采用R 语言绘制基因表达热图。

2 结果与分析

2.1 花生TCP 家族基因的全基因组鉴定

全基因组共获得51 条保守域完整的序列，除TCP 保守域外，还在部分成员发现R 域。研究分别在AABB、AA 与BB 各基因组中获得30 个（AhTCP1 ～AhTCP30）、11（AduTCP1 ～AduTCP11）和10 个（AipTCP1 ～AipTCP10）TCP 家 族 成 员（表1）。结果显示，30 个AhTCPs 位于14 条染色体上，其中染色体13 上分布最多，为4 个。11 个AduTCPs 位于6 条染色体上，其中染色体A03 和A04 分布最多，为3 个。10 个AipTCPs 位于5 条染色体上，其中染色体B03 和B10 上最多，为3 个。

表1 花生TCP 基因家族染色体位置信息Table 1 Chromosome position information of TCP gene family in peanut

续表：

2.2 TCP 家族基因的系统进化分析

通过对花生和拟南芥TCP 家族成员的系统进化分析发现（图1），家族成员在2 物种内相对保守。51 个花生TCP 家族成员聚为ClassⅠ和ClassⅡ两类，又在ClassⅡ划分为CYC/TB1 和CIN 2 个亚类。其中，AhTCPs 在ClassⅠ、CYC/TB1 与CIN 等亚类分别含有12 个、10 个和8 个家族成员；AduTCPs 在各亚类分别含有4 个、3 个和4 个家族成员；AipTCPs分别含有2 个、3 个和5 个家族成员。研究发现部分包含R 域的成员聚在ClassⅡ中。

图1 花生和拟南芥TCP 基因家族进化树Fig .1 Phylogenetic analysis of TCP gene family between Arabidopsis and peanut

2.3 基因结构与Motif 分析

基因结构分析发现，AhTCPs 含有1 ～6 个外显子，其中以1 个外显子（10 个）和2 个外显子（9 个）成员居多（图2a）。AduTCPs 含有1 ～5个外显子（图2b），其中AduTCP4、AduTCP10最多，为5 个；AipTCPs 含有1 ～7 个外显子（图2c），其中AipTCP9最多，为7 个。通过对Motif的比较发现（表2，图3），所有AhTCPs 都存在Motif1-AABB，Motif2-AABB 存 在 于Class Ⅱ的AhTCP2、AhTCP19、AhTCP12、AhTCP28、AhTCP8、AhTCP22、AhTCP15、AhTCP30、AhTCP20、AhTCP6这10 个成员内，Motif3-AABB仅存在于Class Ⅰ，Motif4-AABB 分布于部分成员，Motif5-AABB 仅存在于CYC/TB1；AA 基因组中，Motif1-AA 存在于除AduTCP5外的所有AduTCPs中，Motif2-AA 仅 存 在 于AduTCP8和AduTCP11中，Motif3-AA 存在于所有AduTCPs 中，Motif4-AA 和Motif5-AA 仅存于ClassⅡ；BB 基因组中，Motif1-BB 存 在 于 除AipTCP9外 的AipTCPs 中，Motif2-BB 仅 存 在 于AipTCP6和AipTCP10中，Motif3-BB 仅存于CIN 亚组，Motif4-BB 存在于除AipTCP1 外的所有AipTCPs 中，Motif5-BB 仅存在于ClassⅠ。综上可知，Motif1 构成TCP 保守域，Motif2 构成R 域。

图2 花生TCP 家族基因结构图Fig. 2 Gene structure of TCP family genes in peanut

表2 花生TCP 基因家族Motif 预测及序列信息Table 2 Motif prediction and sequence information of TCP gene family in peanut

2.4 理化性质及亚细胞定位预测分析

理化性质预测分析发现（表3）：AhTCPs 的氨基酸数目在131 ～658 之间，平均分子量为43.53 kD，分别多于AA（83 ～456，30.16 kD）和BB（127 ～455，33.67 kD）基因组的氨基酸数目和平均分子量大小。

表3 花生TCP 蛋白理化性质、二级结构及亚细胞定位Table 3 Physicochemical properties, secondary structure and subcellular location of TCP proteins in peanut

2.5 启动子区顺式作用元件分析

家族成员上游2 000 bp 启动子区顺式作用元件预测发现：AA、BB、AABB 基因组分别发现77、75 和94 种顺式作用元件，其中22 种顺式作用元件与激素响应、植物生长发育和逆境胁迫等相关（图3）。与激素响应相关的家族成员，分别有24 个存在脱落酸反应元件（ABRE）、19 个有生长素应答元件（AuxRR-core 和TGA-element）、44 个有乙烯反应元件（ERE）、26 个有赤霉素反应元件（GAREMotif、P-box 和TATC-box）、27 个有水杨酸反应元件（TCA-element）以及30 个有MeJA 反应调控元件（CGTCA-Motif 和TGACG-Motif）；与植物生长发育调控元件相关的家族成员，分别有15 个存在与分生组织表达相关调控元件（CAT-box 和CCGTCC-box）、20 个存在与昼夜节律调控相关元件（circadian）、17 个存在参与胚乳表达的调控元件（GCN4_Motif）、20 个存在玉米醇溶蛋白调控元件（O2-site）；与逆境胁迫响应元件相关家族成员，分别有43 个存在厌氧诱导元件（ARE）、15个存在低温响应元件（LTR）、24 个存在干旱诱导元件（MBS）、10 个存在防御应激元件（TC-rich repeats）、28 个存在伤口应激元件（WUN-Motif）。

图3 花生TCP 基因家族顺式作用元件分析Fig .3 The analysis of cis-acting elements of TCP gene family in peanut

2.6 花生TCP 基因表达分析

AhTCPs 在‘冀 花5 号’‘和M130’的6 个侧 枝 发 育 时 期（5、10、15、20、25 和30 d）的表达模式分析结果显示（图4），30 个AhTCP 基因共检测到24 个基因，其中AhTCP1、AhTCP4、AhTCP5、AhTCP17、AhTCP25和AhTCP26尚未在转录组中检测到。第Ⅰ组中AhTCP12、AhTCP13、AhTCP14、AhTCP15、AhTCP28和AhTCP30具有相似的表达特征，6 个基因在两品种的6 个生长时期中普遍低水平表达。第Ⅱ组中AhTCP3、AhTCP7、AhTCP16、AhTCP21和AhTCP27具 有相似的表达特征，5 个基因在2 品种的6 个生长时期中普遍高水平表达，其中以AhTCP27表达水平最高。第Ⅲ组中，AhTCP2、AhTCP6、AhTCP8、AhTCP9、AhTCP11、AhTCP19、AhTCP20、AhTCP22、AhTCP23和AhTCP29表达水平均较高。而AhTCP18在2 品种中表达趋势一致，呈现出先降低后升高的表达模式；AhTCP10和AhTCP25在‘冀花5 号’中呈现出先降低后升高的趋势，而在M130呈现逐步降低的趋势。

图4 AhTCPs 基因在栽培种花生侧枝发育中的转录表达模式Fig. 4 Transcriptional expression pattern of AhTCPs in the lateral branch development of the cultivated peanut

3 讨论

随着高通量测序技术的完善，大量物种完成了基因组测序，TCP 转录因子已在多个植物种被鉴定，其家族成员数目不尽相同［10-14］。本研究通过全基因组鉴定获得51 个花生TCP 转录因子家族成员，被划分为两类3 组，与拟南芥TCP 基因家族分类一致［10］；其中ClassⅠ大部分家族成员仅具有编码序列（CDS），内含子数目较ClassⅡ家族成员少，说明花生TCP 基因在进化中序列呈现高度保守状态，与Yao 等［10］研究结果相符。TCP 氨基酸序列与bHLH 氨基酸序列存在较大差异，Marc 等［5］认为这可能是趋同进化的结果；启动子顺式作用元件预测结果中存在与激素响应、生长发育、胁迫应答元件，相关研究结果与Ling 等［22］一致。大量研究表明，拟南芥中的AtTCP11基因参与维管束后生木质部导管分子的分化和形成［23］；AtTCP20基因调控植物生长发育、茉莉酸 (JA) 生物合成及叶片衰老［24］；AtTCP22基因负向调控叶片衰老，并与AtTCP15基因存在功能冗余现象［25］，而花生TCP 家族基因上游2 000 bp 启动子区内的多种顺式作用元件的存在，可推测TCP 家族基因也参与花生生长发育的多个生物学进程。

本 研 究 中AhTCP11、AhTCP29和AtTCP9被划分到ClassⅠ中，具有较高的序列同源性，推测AhTCP11和AhTCP29可能具有类似AtTCP9调控叶片衰老和根系发育［25］的功能；AhTCP5、AhTCP18与AtTCP3、AtTCP4被划分到ClassⅡ中，且具有较高的同源性，推测其可能作为microRNA 的靶基因参与花生叶片发育［26］；AhTCP2、AhTCP19与AtTCP18（TB1 同系物）［27］被划分到ClassⅡ（CYC/TB1）中，且序列同源性较高。水稻OsTB1基因［28］和高粱SbTB1 基因［29］均属于TB1，与拟南芥AtTCP18序列高度同源，过表达后抑制腋芽的发育，减少分蘖的总数，进而影响植物的分枝发育。本研究通过对不同株型花生品种侧枝发育转录表达分析，发现AhTCP2、AhTCP18和AhTCP19在2 品种不同侧枝发育时期存在表达差异，推测3 个基因可能具有调控花生侧枝发育，改变植物形态的作用，其生物学功能有待进一步验证。另外，AhTCP3和AhTCP16基因与AtTCP11［27］基因具有的高同源性，推测AhTCP3和AhTCP16可能参与木质部细胞的形成 与 分 化；AhTCP23和AhTCP9与AtTCP20［28］具有较高的同源性，推测AhTCP23和AhTCP9调控花生叶片衰老。