circ_0007762通过miR-18a-5p调节肺成纤维细胞自噬的机制研究

黄彬，张军，郑金旭△，丁慢玲，吴妍

特发性肺纤维化（IPF）为一类病因未明的慢性进展性纤维化性间质性肺病，以肺泡上皮细胞损伤的异常修复、纤维细胞激活等共同导致的胞外基质（ECM）过度沉积为特征［1-2］。IPF 好发于中老年人，且发病率逐年上升［3］。尽管目前对IPF 病理方面的研究已取得较大突破，但对成纤维细胞在纤维组织重塑过程中激活的机制却了解甚少。环状RNA（circRNA）为一类3'至5'端反向剪接产生的单链闭合环状RNA［4］。circRNA 可作为竞争性内源RNA（ceRNA）竞争微小RNA（miRNA）结合位点，影响miRNA活性并减轻miRNA对靶mRNA的抑制；部分circRNA 结合蛋白后将其定位至特定DNA 序列，并充当蛋白支架分子或蛋白海绵［5-6］。Li 等［7］从数据集GSE102660中发现IPF样本中存在67个表达失调的circRNA，其中circ_0007762明显上调。本研究在预测circ_0007762 的靶miRNA 的基础上，探讨circ_0007762能否通过ceRNA 机制调节自噬这一亚细胞降解途径，影响肺成纤维细胞增殖分化，进而调控IPF进程并促进纤维化样表型，为探索IPF进展的潜在机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 人胚肺成纤维细胞株HFL1、F12K 培养基，青霉素-链霉素（武汉普诺赛生命科技有限公司）；胎牛血清（Gibco 公司）；转化生长因子（TGF）-β1（北京达科为生物技术有限公司）；自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）购自Sigma公司；circ_0007762 小干扰RNA（si-circ_0007762）由广州锐博生物科技有限公司合成；miRNA inhibitor 及mimics 由北京合生生物科技有限公司合成；TransMaxR-100（bioexplorer 公司）；反转录和实时荧光定量PCR 试剂盒（TAKARA 公司）；miRNA反转录试剂盒、CCK-8、BCA试剂盒及ECL发光液（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；PARISTM核质分离试剂盒（赛默飞公司）；HEK293细胞株、circ_0007762引物、双荧光素酶报告基因载体构建（广州吉赛生物科技有限公司）；其他引物（上海生工股份有限公司）；TRIzol、Lipofectamine 2000（Invitrogen 公司）；兔抗GAPDH、Ⅰ型胶原（collagenⅠ）抗体（proteintech公司）；兔抗P62、微管相关蛋白1轻链3β（LC3B）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗体及辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔二抗（CST公司）。

1.2 方法

1.2.1 生物信息学分析 通过GEO 数据库（www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）分 析circ_0007762 在IPF 患 者circRNA 数 据 集GSE102660 中的表达。使用circBank 数据库（www.circbank.cn）获取circ_0007762 基本信息。通过ENCORI（starbase.sysu.edu.cn）及circBank 预测circ_0007762 的靶miRNA 及相应的结合位点，并与GEO 来源的IPF 肺组织miRNA 表达谱GSE13316取交集筛选靶miRNA。

1.2.2 细胞培养、转染及给药分组 HFL1细胞接种于F12K培养基，添加10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素，于5%CO2、37 ℃恒温培养箱培养。通过转染si-circ_0007762 实现circ_0007762 敲低，通过转染miR-18a-5p 模拟物和抑制剂实现miR-18a-5p 的过表达和敲低。接种HFL1 细胞于6 孔板，待其生长至60%～70%融合度时，依照TransMaxR-100 说明书转染si-circ_0007762、miRNA模拟物、抑制剂及相应阴性对照（终浓度50 nmol/L），转染6 h后更换培养基，转染序列见表1。转染后添加TGF-β1（10µg/L）、二甲基亚砜（DMSO，0.1%）或3-MA（5 nmol/L，溶于0.1%DMSO）干预48 h。实验分组如下：（1）正常组（Control组）、TGF-β1组、TGF-β1+DMSO组、TGF-β 1+3-MA 组。（2）si-NC 组（siRNA 阴性对照）、si-circ_0007762组（转染si-circ_0007762）、miR-NC组（转染miRNA单链阴性对照）、miR-18a-5p inhibitor 组（转染miR-18a-5p inhibitor）、mimics-NC 组（转染miRNA 双链阴性对照）、miR-18a-5p mimics 组（转染miR-18a-5p mimics）、si-circ_0007762+miRNC组、si-circ_0007762+miR-18a-5p inhibitor组。

Tab.1 Synthetic gene sequences表1 合成物基因序列

1.2.3 Sanger测序及实时荧光定量PCR 委托广州吉赛生物科技有限公司利用sanger 测序检测环化位点，验证circ_0007762 引物特异性。TRIzol 法提取细胞总RNA 后，进行反转录和实时荧光定量PCR，以2-ΔΔCt表示目的基因相对表达水平。PCR 反应条件：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，40 个循环。以GAPDH 为内参，检测给药或转染后的circ_0007762表达改变，以U6 为内参检测miR-18a-5p、miR-135a-5p、miR-135b-5p水平变化，各引物序列见表2。实验分组如下：（1）Control 组、TGF-β1 组。（2）si-NC 组、si-circ_0007762 组。（3）miR-NC 组、miR-18a-5p inhibitor 组。（4）mimics-NC 组、miR-18a-5p mimics组。

1.2.4 荧光原位杂交（FISH）及核质分离实验 HFL1细胞爬片由4%多聚甲醛固定5 min，0.5%Triton X-100 于室温孵育后无水乙醇洗涤。Cy3 标记的circ_0007762 探针变性：88 ℃5 min，4 ℃3 min。加入探针杂交，37 ℃孵育过夜。第2天弃杂交液后2×含盐的柠檬酸钠缓冲液（SSC）漂洗爬片。50µL DAPI-Antifade 溶液滴于载玻片，将爬片倒扣在液滴上并封片，避光20 min 以上，通过激光共聚焦显微镜观察。利用PARISTM试剂盒分离细胞核和细胞质蛋白及RNA，分别对2种RNA进行实时荧光定量PCR检测。

Tab.2 Primer sequences for qPCR表2 qPCR引物序列

1.2.5 双荧光素酶报告基因检测 通过PCR 分别扩增包括miR-18a-5p结合位点的circ_0007762 3'UTR序列，将目的片段连接入psiCHECK2 载体中，得到野生型circ_0007762 3'UTR 报告基因载体circ_0007762 WT。上述序列突变并扩增后连接入psiCHECK2 载体，得到突变型载体circ_0007762 MUT。参照说明书使用Lipofectamine 2000 共转染1µg 报告基因载体与终浓度100 nmol/L 的miR-18a-5p mimics 或mimics-NC 至HEK293 细胞中。48 h 后收取细胞，用发光仪检测荧光素酶活性。

1.2.6 细胞增殖实验 将HFL1细胞（约3×103/孔）接种至96孔板，在37 ℃培养24 h 后进行转染。实验分组如下：（1）si-NC 组、si-circ_0007762 组、si-circ_0007762+miR-NC 组、sicirc_0007762+miR-18a-5p inhibitor组。（2）Control组、TGF-β1组、TGF-β1+DMSO组、TGF-β1+3-MA组。分别于转染后0、24、48、72 h 添加CCK-8 试剂10µL/孔，37 ℃孵育1 h 后测量450 nm 处的光密度，计算各组间细胞活力。细胞活力＝（给药组光密度-空白组光密度）/（正常组光密度-空白组光密度）×100%。

1.2.7 Western blot 实验分组如下：（1）Control 组、TGF-β1组、TGF-β1+si-NC 组、TGF-β1+si-circ_0007762 组、TGF-β 1+si-circ_0007762+miR-NC 组、TGF-β1+si-circ_0007762+miR-18a-5p inhibitor 组。（2）TGF-β1 组、TGF-β1+DMSO 组、TGF-β1+3-MA组。提取各组HFL1总蛋白，BCA法定量后蛋白变性。取30µg进行电泳、转膜及封闭后，4 ℃兔抗一抗孵育过夜：GAPDH 抗体（1∶5 000）；collagenⅠ抗体（1∶3 000）；P62、LC3B、α-SMA抗体（1∶1 000）。HRP标记的山羊抗兔二抗（1∶3 000）室温孵育1 h，暗室内使用ECL 发光液显影曝光及Image J软件分析上述蛋白相对表达水平。

1.2.8 统计学方法 使用Graphpad Prism 8.3.0 及SPSS 22.0软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，2组间均数比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 circ_0007762 的miRNA 靶标的预测及筛选结果 通过对GEO 数据库的数据集GSE102660 分析发现，circ_0007762在IPF中上调，见图1A。circBank查询结果提示circ_0007762定位于6号染色体q24.3片段（147581750-147599340），由外显子反向剪接形成，见图1B。利用circBank 及ENCORI 分别预测出25个和17个circ_0007762的miRNA靶点，将两者与GEO 数据集GSE13316 中504 个下调的miRNA 取交集，初步筛选出circ_0007762可能的靶miRNA：miR-18a-5p、miR-135a-5p、miR-135b-5p，见图1C。

Fig.1 The circ_0007762 pattern and the screening of its target miRNAs图1 circ_0007762模式图及其靶miRNA筛选

2.2 TGF-β1 干预后HFL1 细胞中circ_0007762 及miRNA 表达变化 Sanger 测序示circ_0007762 的PCR 产物环化位点（图2A）。与Control 组相比，在TGF-β1干预HFL1 48 h后，circ_0007762、miR-135a-5p 和miR-135b-5p 表达水平上调（P＜0.05），miR-18a-5p表达下调（P＜0.05），见图2B、C。miR-18a-5p与circ_0007762存在竞争性结合的可能性更大。

2.3 circ_0007762 竞争性结合miR-18a-5p 荧光原位杂交及核质分离结果显示circ_0007762细胞质分布多于细胞核，见图3。利用ENCORI数据库证实circ_0007762 存在miR-18a-5p 结合位点，见图4A；荧光素酶实验结果显示，在circ_0007762 WT 中，与mimics-NC 组相比，miR-18a-5p mimics 组荧光素酶活性明显减弱（P＜0.05），见图4B，证明两者存在内源性结合。此外，抑制circ_0007762 表达后可上调miR-18a-5p 表达水平（P＜0.05），见图5A。抑制miR-18a-5p 表达可上调circ_0007762 表达水平，增强miR-18a-5p 表达则下调circ_0007762 表达水平（P＜0.05），见图5B、C。

2.4 敲低circ_0007762 对细胞增殖的抑制作用及miR-18a-5p 对其影响 CCK-8 结果显示，与si-NC组比较，si-circ_0007762组HFL1细胞增殖活性受到抑制（P＜0.05），然而si-circ_0007762+miR-18a-5p inhibitor 组 与si-circ_0007762+miR-NC 组 相 比，HFL1 增殖活性升高（P＜0.05），敲低miR-18a-5p 的表达逆转了si-circ_0007762 对HFL1 细胞的增殖抑制作用，见图6、表3。

Fig.2 The cyclization site of circ_0007762 and changes of circ_0007762 and miRNAs after TGF-β1 intervention图2 circ_0007762环化位点及TGF-β1干预后HFL1细胞中circ_0007762及miRNA表达变化

Fig.3 Subcellular localization of circ_0007762图3 circ_0007762亚细胞定位

2.5 敲低circ_0007762抑制肺成纤维细胞纤维化相关表型并激活自噬的作用及抑制miR-18a-5p 对其影响 Western blot 结果显示，在HFL1 细胞中，与Control组相比，TGF-β1干预后α-SMA、collagenⅠ表达升高；相反，siRNA 敲低circ_0007762 表达后α-SMA、collagenⅠ表达下降，纤维化受到抑制，并且其对α-SMA、collagenⅠ表达的影响可被miR-18a-5p的抑制所逆转（P＜0.05），见图7、表4。相较于Control组，TGF-β1干预后P62表达降低，同时LC3BⅡ/Ⅰ升高，自噬活化；相反，siRNA 敲低circ_0007762 表达后P62 表达上调，同时LC3BⅡ/Ⅰ降低，自噬被抑制；并且si-circ_000776 对P62 及LC3BⅡ/Ⅰ表达的影响可因miR-18a-5p 的抑制所逆转（P＜0.05），见图7、表4。

Fig.4 Binding sites of circ_0007762 to miR-18a-5p and results of dual-luciferase assay图4 circ_0007762与miR-18a-5p的结合位点及双荧光素酶检测结果

Fig.5 The interaction between circ_0007762 and miR-18a-5p图5 circ_0007762与miR-18a-5p的相互作用关系

Fig.6 Effects of circ_0007762 and miR-18a-5p inhibition on HFL1 proliferation图6 抑制circ_0007762及miR-18a-5p表达对HFL1增殖的影响

Tab.3 Comparison of HFL1 cell viability between the four groups表3 各组间HFL1细胞活力差异（n=3，%，±s）

Tab.3 Comparison of HFL1 cell viability between the four groups表3 各组间HFL1细胞活力差异（n=3，%，±s）

**P＜0.01，a 与si-NC 组比较，b 与si-circ_0007762+miR-NC 组比较，P＜0.05。

组别si-NC组si-circ_0007762组si-circ_0007762+miR-NC组si-circ_0007762+miR-18a-5p inhibitor组F 24 h 129±6 105±14a 89±8 121±14b 7.672**48 h 229±31 184±23 165±26 194±24 3.151 72 h 393±31 318±17a 256±27 355±28b 14.761**

Fig.7 Effects of circ_0007762 and miR-18a-5p inhibition on protein expression in HFL1 cells图7 抑制circ_0007762及miR-18a-5p表达对HFL1细胞蛋白表达的影响

2.6 自噬抑制剂3-MA缓解了肺成纤维细胞增殖及纤维化表型 TGF-β1 加速了HFL1 细胞的增殖，而与TGF-β1+DMSO 组比较，3-MA 的 干预抑制了HFL1 细胞的增殖（P＜0.05），见图8、表5。此外，TGF-β1+3-MA 组较TGF-β1+DMSO 组collagenⅠ、α-SMA 表达下调，LC3BⅡ/Ⅰ下降，而P62 表达上调，通过抑制细胞自噬缓解了纤维化（P＜0.05），见图9、表6。

Tab.4 Comparison of autophagy and fibrosis related protein expression between the six groups表4 各组自噬及纤维化相关蛋白表达的比较 （n=3，±s）

Tab.4 Comparison of autophagy and fibrosis related protein expression between the six groups表4 各组自噬及纤维化相关蛋白表达的比较 （n=3，±s）

**P＜0.01；a与Control组比较，b与TGF-β1+si-NC组比较，c与TGF-β1+si-circ_0007762+miR-NC组比较，P＜0.05。

组别Control组TGF-β1组TGF-β1+si-NC组TGF-β1+si-circ_0007762组TGF-β1+si-circ_0007762+miR-NC组TGF-β1+si-circ_0007762+miR-18a-5p inhibitor组F α-SMA 1.00±0.02 2.46±0.21a 2.06±0.13 1.13±0.13b 1.04±0.15 1.96±0.11c 60.794**collagen Ⅰ1.00±0.00 2.31±0.20a 1.94±0.10 1.09±0.06b 1.36±0.15 2.63±0.09c 94.044**P62 1.00±0.01 0.47±0.07a 0.42±0.06 0.89±0.06b 0.81±0.13 0.40±0.11c 30.874**LC3BⅡ/Ⅰ1.00±0.03 2.80±0.17a 2.65±0.16 1.43±0.07b 1.68±0.41 3.88±0.34c 59.812**

Fig.8 Effects of 3-MA on HFL1 proliferation induced by TGF-β1图8 3-MA对TGF-β1诱导的HFL1增殖的影响

Tab.5 Differences in HFL1 cell viability between the four groups表5 各组间HFL1细胞活力差异（n=3，%，±s）

Tab.5 Differences in HFL1 cell viability between the four groups表5 各组间HFL1细胞活力差异（n=3，%，±s）

**P＜0.01；a与Control组比较，b与TGF-β1+DMSO组比较，P＜0.05。

组别Control组TGF-β1组TGF-β1+DMSO组TGF-β1+3-MA组F 72 h 372±27 486±52a 466±35 297±44b 14.003**24 h 133±7 156±17 171±7 112±18b 11.450**48 h 238±24 273±24 269±9 189±14b 12.515**

Fig.9 Effects of 3-MA on protein expression induced by TGF-β1 in HFL1 cells图9 3-MA对TGF-β1诱导的HFL1细胞蛋白表达的影响

Tab.6 Comparison of autophagy and fibrosis related protein expression between the three groups表6 各组自噬及纤维化相关蛋白表达水平比较（n=3，±s）

Tab.6 Comparison of autophagy and fibrosis related protein expression between the three groups表6 各组自噬及纤维化相关蛋白表达水平比较（n=3，±s）

**P＜0.01；a与TGF-β1组比较，b与TGF-β1+DMSO组比较，P＜0.05。

组别TGF-β1组TGF-β1+DMSO组TGF-β1+3-MA组F α-SMA 1.00±0.01 0.89±0.16 0.35±0.06ab 37.295**collagen Ⅰ1.00±0.04 1.02±0.05 0.57±0.05ab 85.386**P62 1.00±0.08 1.00±0.09 1.66±0.26ab 15.614**LC3BⅡ/Ⅰ1.00±0.02 1.06±0.07 0.60±0.13ab 26.530**

3 讨论

circRNA 与miRNA 的结合对IPF 进展起关键作用，近年多个研究发现该机制涉及IPF 中肺成纤维细胞功能异常。Zhang 等［8］发现circ_0044226 可充当miR-7的ceRNA，增强人胚肺细胞WI38细胞向肌成纤维细胞的转化。而circTADA2A作为miR-526b或miR-203 的ceRNA 可调控小窝蛋白1/2 的表达，抑制肺成纤维细胞的激活，减轻ECM 沉积并缓解IPF 进程［9］。Zhang 等［10］发现miR-18a-5p 在纤维化小鼠及胸膜间皮细胞中表达降低，并靶向抑制TGFβ 受体2 缓解类上皮间充质转化。本研究发现，miR-18a-5p 在TGF-β1 诱导的肺成纤维细胞中降低，可能是IPF 中重要的保护性因子。并且抑制circ_0007762可促进miR-18a-5p表达，而抑制miR-18a-5p 同样可上调circ_0007762 表达，两者呈负调控关系。双荧光素酶实验进一步揭示了两者的内源性结合。由此可见，circ_0007762 可充当miR-18a-5p 的ceRNA，通过负调控miR-18a-5p，作为重要的促纤维化因子，诱导肺成纤维细胞发生纤维化表型。

肺成纤维细胞对损伤修复至关重要，其异常激活对IPF进展最为关键［11］。肺成纤维细胞受促纤维化介质诱导而异常活化增殖，增强ECM 分泌，后者加速肌成纤维细胞分化（FMT）及ECM 合成的前馈循环，使肺纤维化程度持续加剧［12］。TGF-β1是IPF中最强的促纤维化因子，以往有报道其对肺泡上皮细胞及成纤维细胞增殖存在调控作用，可抑制肺泡上皮细胞增殖而促进成纤维细胞增殖［13-14］。本实验表明circ_0007762可促进HFL1细胞的活化与增殖，且该作用可被miR-18a-5p 所逆转，提示circ_0007762对细胞增殖调控部分是通过miR-18a-5p变化而实现的。

自噬是选择或非选择性对胞质物质进行降解的适应性过程，以巨噬、微噬和伴侣介导的自噬为主要的3 种类型［15-16］。大量证据揭示自噬参与IPF 的发病环节，但目前对两者的关系尚且存在争议。Hill等［17］认为在IPF 肺组织中自噬受损，抑制自噬可通过NF-κB/Snail2 通路促进类上皮间充质转化。然而，另有研究发现自噬正向调控TGF-β1 诱导的细胞纤维化过程；首先，自噬有助于肺泡巨噬细胞的凋亡抵抗，这是肺纤维化发展所必需的［18］，其次，TGFβ1诱导IPF和非IPF肺成纤维细胞中collagenⅠ及纤连蛋白的生成，同时促进自噬体的积累，激活自噬通量［19］。此外，有报道阿奇霉素显著减少了TGF-β干预后的成纤维细胞胶原分泌，治疗过程伴随着溶酶体功能受损［20］。本研究证实TGF-β1 可激活自噬，并伴随胶原产生增强及α-SMA 这一肌成纤维细胞标志物升高，表明自噬可能参与肺纤维化早期的启动环节。此外，在circ_0007762 抑制后自噬受到抑制，HFL1 的FMT 改变得到改善，胶原分泌减少。而抑制circ_0007762 后上述受损过程同样可由miR-18a-5p 下调有所恢复，这揭示circ_0007762 参与自噬的活化，能激活肺成纤维细胞增殖，抵抗FMT 变化，并且该过程一定程度上受miR-18a-5p影响。总体来看，自噬在IPF肺组织与TGF-β1诱导的纤维化模型的差异性可能由两者所处病程的不同来解释，细胞模型更趋于纤维化早期发展，而IPF 肺组织样本则呈现纤维化终末期变化，其中可能存在微环境的适应过程。非IPF 来源的肺成纤维细胞对collagenⅠ敏感，在应激时凋亡增加，而IPF成纤维细胞因长期暴露于该微环境导致对collagenⅠ脱敏［21］。此外，自噬还参与细胞增殖的调控，有研究发现3-MA可抑制骨分化和增殖，自噬激活剂雷帕霉素则可增强成骨分化和增殖［22］。同时自噬介导了接触抑制所致的增殖减少［23］。本研究中，在使用3-MA 阻断自噬通量后，HFL1 增殖活性受抑制，这揭示了自噬可以促进肺成纤维细胞的活化增殖。

综上所述，本研究证明circ_0007762 可作为miR-18a-5p的ceRNA，通过激活自噬活化肺成纤维细胞增殖，加速FMT，诱导纤维化表型，为理解circ_0007762 介导的肺纤维化机制提供了新的信息。然而，本研究仅通过体外验证circ_0007762 及miR-18a-5p 对肺成纤维细胞的影响，IPF 的病变过程涉及多细胞功能失调，除成纤维细胞外，还累及肺泡上皮细胞及巨噬细胞等。此外，circ_0007762 改变在体内的效应可能不同于体外，这需要进一步研究。