大理某规模化猪场仔猪流行性腹泻诊断及防制

杨建东，赵一松

(洱源县农业农村局，云南 洱源 671200)

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)属于单股正链RNA病毒，该病原仅能感染猪，从而引发猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea, PED)。不同发育阶段猪对PEDV均易感，但仅仔猪和保育猪感染该病后出现严重的临床症状，如腹泻、呕吐和严重脱水等，且该病对仔猪具有较高的致死性[1];虽然育肥猪和母猪感染PEDV后不出现明显临床症状，但此类猪群处于隐性感染情况，可持续性对外排毒，仍然对其他健康猪群产生巨大的威胁[2]。根据PEDV基因组特征，当前我国猪场流行的PEDV毒株可分为传统株(以PEDV CV777毒株为代表)和变异株，且目前流行的PEDV毒株以变异株为主。研究表明，当前使用的传统疫苗(基于PEDV CV777毒株研发)对PEDV变异株防控效果较差，导致我国PED流行情况更加严峻[3]。

可导致仔猪腹泻的病原种类繁多，其中包括PEDV、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德塔冠状病毒(PDCoV)、猪轮状病毒(PoRV)、猪伪狂犬病毒(PRV)及猪圆环病毒二型(PCV2)常见病毒性病原，同时也存在大肠杆菌、巴氏杆菌、猪球虫等诸多寄生虫和细菌性病原。不同病毒(尤其是腹泻病毒)感染导致仔猪腹泻临床症状和病理变化差异较小，依靠传统的临床诊断无法准确确定病原，特别是多种病原混合感染时，无疑会延误疾病的防治[4]。

2021年10月初，大理某规模化猪场仔猪发生腹泻疫情，且发病仔猪死亡率较高，给该场造成较大的经济损失。为确定发病原因，笔者随机挑选2只因腹泻死亡仔猪，采集组织病料(小肠、淋巴结和肺脏等)进行实验室诊断，现将试验结果进行总结以供同行参考，旨在为PED的防控提供科学依据。

1 发病情况

大理某规模化猪场饲养能繁母猪400余头，2021年10月初，该场一栋猪舍新生仔猪(2～3日龄)首先发病，主要表现为发热、腹泻、精神差、呕吐等。起初栏舍饲养员误认为是仔猪群受风寒所致，故提高猪舍内温度，同时给发病仔猪肌肉注射青霉素和复方氨基比林，但效果不理想。仔猪在发病一周内严重腹泻，甚至可见粪便中残留脱落的肠黏膜，最后因严重脱水而死亡。值得注意的是，该猪场母猪群未出现明显的不适症状。

2 剖检变化

随机选择2头因腹泻死亡仔猪进行剖检，发现病理变化基本一致。腹泻仔猪因严重脱水而眼窝深陷，且呈现“皮包骨”样。剖检可见病变主要位于胃部和肠道，其中胃内含有未消化的凝乳块，且存在较重的腥味；肠系膜淋巴结充血肿大，小肠壁因腹泻变薄甚至为半透明状；划开小肠可见黄色液体，有腥臭味。

3 实验室诊断

3.1 病毒核酸检测结果

在检查发病仔猪临床症状和剖检变化后，采集其腹股沟淋巴结、肺脏、肝脏、肾脏和小肠组织样品送至实验室进行检测。使用灭菌手术刀和眼科剪取少量淋巴结、肺脏和小肠组织，加入适量的灭菌PBS溶液和少许钢珠进行匀浆研磨；取研磨后的匀浆液反复冻融，其后低温(4℃)高速(10000r/min)离心5min，取上清液保存于-80℃，待检。

取适量上清液，采用DNA/RNA基因组试剂盒提取滤液中病毒核酸(DNA和RNA基因组)，将核酸样品保存于-80℃，待检。使用商业化的real-time PCR试剂盒分别检测待检样品中是否存在PEDV、PDCoV、PoRV、TGEV、PRV、PCV2常见病原核酸，且每次检测均设置阴性和阳性对照。结果发现，仅2份样品PEDV核酸阳性，且其Ct值较低，均低于20，而其他病原均为阴性。结合临床诊断和实验室检测结果，可判断该场仔猪腹泻由PEDV感染所致。

3.2 PEDV S1基因部分序列扩增与分析

为确定该场暴发毒株的基因型，采用RT-PCR法对1份阳性样品S1基因部分序列进行扩增、测序与分析。扩增S1基因序列引物参考PEDV毒株(KT323979.1)设计，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。其序列为PEDV-S1-F：′5-ATGAAGTCTTTAAATTACTTCT-3′；PEDV-S1-R：′5-AGTCCATAAATCTTAGGAATG-3′。RT-PCR体系(25.0 μL)包含2×PCR预混液12.5μL、上下游引物各0.5μL、cDNA模板2.0μL及无RNA酶水9.5μL；反应条件为95℃ 5min；95℃ 30s、56℃ 30s、72℃ 30s，共30个循环；最后72℃ 5min，每次反应均设置阳性和阴性对照，其中阳性对照为已知PEDV cDNA基因组，阴性对照为无RNA酶水。反应结束后取少量RT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察结果后将剩余产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。测序结果返回后，将序列载入至NCBI网站进行BLAST，与国内外流行毒株进行同源性比较，确定该毒株的基因型。

对RT-PCR产物进行凝胶电泳，发现其产物大小约为850bp(图1)，进一步测序结果表明该毒株S1基因序列大小为855bp。核苷酸序列同源性分析结果表明该毒株与GenBank收录的国内流行变异株(JN599150.1)同源性最高(99.8%)，但与PEDV CV777毒株为代表的传统株对应基因序列同源性仅为92.5%，提示该毒株为变异株。

M: DL2000 DNA marker；1: 检测样品；+: PEDV阳性对照；-: 阴性对照。

4 防制措施

确定该猪场暴发的仔猪腹泻是由PEDV变异株感染所致后，为有效防控该病，采取以下防制措施：①将发病仔猪和假定健康猪群隔离饲养，将已无治疗意义的发病仔猪进行扑杀，并无害化处理；②对猪场所有仔猪紧急免疫接种基于PEDV变异株研发的灭活疫苗(科泻宁)，同时对需要补免的母猪进行免疫接种；③清除猪场粪污，对猪场及周围环境进行彻底消毒；在猪场走廊铺撒生石灰等，保持猪场干燥；④对发病仔猪进行对症治疗，如在饮水中添加电解多维和葡萄糖等，在仔猪奶粉中添加适量抗生素，防止继发感染其他病原；⑤禁止猪场各栏舍兽医或饲养员穿梭于发病栏舍和健康栏舍。10月中下旬回访该场，实施以上防控措施后该场仔猪腹泻情况得到有效控制；11月初再次回访，该场未发生仔猪腹泻、呕吐等疑似PEDV感染症状。

5 讨论

仔猪腹泻在生猪养殖过程中十分常见，但可引起该病的病原种类繁多，如PEDV、TGEV和PDCoV等，但这些病原所导致的疾病临床特征十分类似，仅依靠临床诊断无法确定病原，甚至会因错过疾病防控最佳时间而造成巨大的经济损失。PEDV广泛流行于我国猪场，气候环境改变或饲料不洁等因素均可诱使猪场发生PED[5]，继而造成严重的损失。当前我国流行的PEDV毒株可分为2个基因型，分别为传统株和变异株，有研究表明，基于传统株研发的疫苗对变异株的流行预防效果不好[3]，因此，若猪场暴发PED，需要确定致病毒株的基因型，根据流行毒株基因型选择对应的疫苗进行免疫，以争取疾病尽早得到有效控制。研究表明，不同基因型PEDV毒株M基因序列存在较大差异，分析该基因序列可有效区分变异株和传统株[6，7]。

本文中，通过实验室诊断技术对组织样品中多种可能导致仔猪腹泻的病毒进行检测，发现被检测样品仅为PEDV阳性。为确定该场流行毒株的基因型，经扩增、测序并分析该毒株的S1基因序列，发现该毒株与PEDV变异株对应序列同源性最高，确定该毒株为PEDV变异株。在确定该场暴发的PED是由变异株感染所致后，制定了一系列具有针对性的防制措施，其中最重要的就是对猪群紧急免疫接种基于PEDV变异株研发的灭活疫苗，这有利于该病的迅速防控。其次，提高猪场生物安全水平和定期消毒等也十分重要。