云南省某土杂鸡场禽白血病诊断及=gp85基因序列分析

张振兴，吉涛，董正勖，胡骑，王斌，宋建领*

(1.云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南 昆明 650224；2.云南省种羊繁育推广中心，云南 昆明 655204； 3.威信县动物疫病预防控制中心，云南 威信 657900)

禽白血病(Avian Leukosis，AL)是由禽白血病病毒( Avian Leukosis Virus， ALV)引起的禽类多种肿瘤性疾病的统称[1]，其主要特征为脾脏、肝脏异常肿大，7周龄以上患病鸡中易产生淋巴样肿瘤等，造成鸡群体重降低，产蛋量减少，严重者引起患病鸡整体免疫能力下降，产生免疫抑制反应，从而继发其他病毒或细菌混合感染等，给肉鸡、蛋鸡的养殖管理带来了巨大的困难和挑战[2]。ALV属于反转录病毒科α 肿瘤病毒属，依据ALV囊膜糖蛋白抗原的不同以及与宿主特异性相关的 gp85 蛋白抗原性的不同，又将ALV分为 A—K 11个亚群[3]，其中A、B、C、D、J、K等六个亚群为外源性ALV，其他亚群为内源性ALV。外源性ALV对鸡群具有较高的致病性，而内源性ALV因主要以前病毒的形式存在，对鸡群的致病性较低。20世纪80年代末由英国学者首次从感染肉鸡中分离得到一株J亚群ALV(ALV-J)，我国于1999年由杜岩等分离得到第一株 ALV-J[4-6]，随后几年间，山东、河南、四川等地也陆续出现确诊为ALV-J感染的报道。本实验确诊了云南省石林县某土杂鸡养殖场鸡肿瘤疫病发病原因主要为ALV-J感染所致，同时对该病原gp85基因进行了遗传进化分析，为该场鸡白血病的防控提供了科学依据。

1 患病鸡场概况

2020年2月，云南省石林县某土杂鸡场出现大量食欲不振、体重严重下降的鸡只，且主要发生于7～16周龄。通过解剖发现，肝脏、脾脏异常肿大，并在肝脏、脾脏、肾脏、法氏囊中发现淋巴瘤等。

2 材料与方法

2.1 病料的采集和处理

采集5只不同鸡舍患病鸡脾脏、肝脏、法氏囊等组织病料，于无菌超净台进行混合剪碎研磨，按照体积比1∶10的比例加入PBS，反复冻融3次后，用离心机3000r/min进行离心10min，取上清液提取核酸。检测所需阳性对照均为本实验室已经测序后的阳性样品。

2.2 核酸提取

按照RNA/DNA核酸提取试剂盒说明书，分别提取上清液中的核酸。

2.3 主要试剂

TaKaRa DNA核酸提取试剂盒、RT-PCR试剂盒、PCR试剂盒、DL-2000Marker等， 均购自宝生物工程(大连)有限公司。

2.4 主要仪器

超净工作台(型号为LA2-4A1)，购自ESCO公司;PCR仪(型号为9700)，购自美国ABI(Applied Biosystems Inc)公司；凝胶成像系统(型号为2000)，购自美国伯乐BIO-RAD公司。

2.5 病原核酸检测

根据国内外已发表的ALV基因序列、鸡传染性贫血病病毒(CAV)基因序列、鸡马立克氏病病毒(MDV)基因序列、禽腺病毒(FAdV)基因序列、禽网状内皮组织增生病病毒(REV)基因序列及参照参考文献[7-9]，分别设计引物ALV-F/ALV-R、CAV-F/CAV-R、MDV-F/MDV-R、FAdV-F/FAdV-R、REV-F/REV-R,引物信息见表1，引物由北京擎科生物科技有限公司昆明分公司合成。

表1 引物序列信息

2.6 gp85基因扩增和序列分析

选择鸡群中有ALV感染的典型临床症状和剖检变化且经过RT-PCR检测ALV核酸呈阳性的样品，进行胶回收。回收后的DNA送往云南省昆明市生工生物工程有限公司进行测序。通过DNAStar MegAlign软件对测序结果进行gp85基因序列比对和遗传进化分析。

3 结果与分析

3.1 病原核酸检测

经1.2% 琼脂糖凝胶电泳后，经凝胶成像系统检测反应结果显示，所获得的目的条带中在约545bp 处有一条带与ALV预期条带相符且与阳性对照组处于同一长度位置，阴性对照组无相应条带，进一步验证该土杂鸡场发病原因为感染ALV(图1)。CAV、MDV、FAdV、REV核酸检测均为阴性(图2—图5)。

M：DNA相对标准分子量；1:阳性对照；

M：DNA相对标准分子量；1:阳性对照；

M：DNA相对标准分子量；1:阳性对照；

M：DNA相对标准分子量； 1:阳性对照；

M：DNA相对标准分子量；1:阳性对照；

3.2 gp85基因序列分析

PCR产物测序后，从 GenBank上下载有关ALV的相关序列作为参考毒株(见表2)，并通过DNAStar软件对核苷酸序列同源性进行比对发现(见表3)，云南省石林县某土杂鸡场ALV阳性样品2020SL与ALV-J的gp85核苷酸序列同源性较高，同源性在75%～94.2%，其中与2010年国内分离得到的ALV-J亚群毒株KC711043-J同源性最高，为94.2%；与埃及ALV-J亚群毒株DQ316908-J同源性最低，为75%；与其他ALV-J亚群毒株同源性在90.1%～92.7%；与A亚群代表毒株MF926337-A的同源性为48.9%；与B亚群代表毒株JF826241-B同源性为49.6%；与C亚群代表毒株KY5490695-C同源性为49.6%；与D亚群代表毒株KY490696-D同源性为49.5%；与E亚群代表毒株KC610517-E同源性为49.2%。遗传进化分析结果显示(图6)，云南省石林县某土杂鸡场ALV阳性样品2020SL与其他8株ALV-J亚群毒株均在GroupⅠ分支上，而ALV A—E亚群毒株在另一分支GroupⅡ上。综合上述结果表明，云南省石林县某土杂鸡场ALV阳性样品2020SL属于ALV-J亚群，且该鸡场感染的ALV毒株gp85基因变异较小。

表2 参考毒株信息

表3 ALV gp85基因核苷酸同源性分析

图6 ALV gp85基因遗传进化分析

4 讨论

禽白血病、马立克氏病、鸡传染性贫血、网状内皮组织增生等免疫抑制病的共同特征是侵害机体的免疫器官,导致机体免疫力下降,感染鸡群后一般不表现临床症状, 通常是亚临床感染或混合感染,后期引起内脏器官肿大或形成肿瘤， 给养禽业造成巨大的经济损失[7]。另外禽腺病毒4型、巴氏杆菌、弧菌性肝炎等也可以引起家禽内脏器官肿大，因此，引起家禽肿瘤性疫病或内脏肿大的病因很难通过临床剖检确诊。为了针对性采取防控措施，必须通过实验室检测技术，找到发病原因，才能获得比较理想的防控效果。本研究通过RT-PCR检测结合基因序列分析，发现云南省石林县某土杂鸡场的主要病因是感染了ALV，为该场的疫病防控提供了科学依据。

ALV-J亚群囊膜糖蛋白的gp85 基因与其他亚群ALV 相比, 缺少93-126 碱基对, 与其他A—E 亚群ALV 的gp85 基因只有40%同源性,因此, gp85 囊膜糖蛋白是ALV-J 的亚群表型决定因素[10]。本研究通过比对Genbank收录的ALV gp85基因分析结果发现，云南ALV gp85基因与ALV-J亚群毒株的gp85基因同源性为75%～94.2%，与其他亚群gp85基因同源性仅为48.9%～49.6%；与2010年国内分离得到的ALV-J亚群毒株KC711043-J同源性最高，为94.2%，与埃及J亚群毒株DQ316908-J同源性最低，为75%。证明此次阳性样品属于ALV-J亚群感染，也预示着近几年J亚群ALV一直处于缓慢地变化之中[11，12]。因此推断，可以利用ALV囊膜糖蛋白基因gp85作为参考，对ALV的分子流行病学特点及遗传进化做更深一步的探究[13]。

禽白血病可通过垂直传播和水平传播引起成年肉鸡、蛋鸡和地方品种鸡[14，15]发病，目前缺乏有效的疫苗和药物，只有通过种群的净化和生物安全措施才能做到有效防控[16-18]。《中华人民共和国动物防疫法》(修订版)、“十四五”全国畜牧兽医行业发展规划等都强调加强种畜禽疫病净化工作，因此，在加快畜禽种业自主创新的同时，做好种鸡群的白血病净化工作，为养殖场提供优质的鸡苗，是防控禽白血病垂直传播的重要举措。外源性ALV污染弱毒疫苗是鸡群中ALV水平传播的最可能因素之一[19-21]，建议养鸡场购买信用度高的正规疫苗生产厂家的疫苗进行免疫，切断因疫苗免疫造成该病水平传播的途径，保障鸡群健康。