土霉素菌渣降解菌的筛选及应用条件优化

康润泽，钱斯日古楞，倪巍洪，杜欣欣，于耀东，王红英

(大连工业大学 生物工程学院，大连 116034)

土霉素菌渣是龟裂链霉菌(Streptomycesrimosus)发酵生产土霉素过程中产生的酸性固态废弃物，是在土霉素提取过程中，加入草酸等试剂酸化过滤后产生的[1]，因此呈酸性，主要含有土霉素生产发酵培养基成分、生产用菌体和产品分离、提纯所用的试剂以及残留的土霉素等[2]。2008年抗生素菌渣列入《国家危险废物名录》，禁止用作饲料或饲料添加剂[3]。土霉素菌渣含水量高、热值低，在烘干和焚烧过程中需要大量的外部热量和燃料，因此其处置成本较高[4-6]。我国虽没有明文规定抗生素菌渣不能作为肥料使用，但其存在菌渣处理不完全、制备的有机肥可能含有的抗生素残留或代谢中间产物，在生物体内累积，产生抗药性等潜在的生态风险[7-9]。如何在环境友好、安全的前提下，合理有效地利用菌渣是目前亟待解决的重要课题[10-11]。

本研究通过筛选能够耐受土霉素菌渣并能产生蛋白质酶的菌株，旨在利用该菌株对土霉素菌渣进行发酵处理，充分利用菌渣成分，获得可再利用的发酵液，作为培养基成分重新利用于土霉素生产中，在节省资源的同时，达到菌渣的无害化处理目的。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

土霉素菌渣和土霉素菌渣堆肥，均由内蒙古华曙生物科技有限公司提供。

1.1.2 试剂与仪器

土霉素标准品(HPLC≥95%)，北京索莱宝科技有限公司销售；蔗糖、赖氨酸、Folin-酚试剂、茚三酮、重铬酸钾等试剂均为国产分析纯。TU-1901紫外分光光度计，北京谱析通用仪器公司；TGL-16K高速冷冻离心机，湘仪离心机仪器有限公司；霉菌培养箱MJ-16085-III，上海新苗医疗器械制造有限公司；ZHWY2102C立式双层恒温摇床，上海智城分析仪器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培养基的配制

5%菌渣培养基：称取干燥的400目土霉素菌渣粉末5 g加到100 mL自来水中混匀，pH值自然，用高压灭菌锅灭菌121 ℃，20 min，备用。配制5%的菌渣固体培养基需要加入5 g琼脂以确保凝固性。

10%菌渣培养基：称取干燥的400目土霉素菌渣粉末10 g加到100 mL自来水中混匀，pH值自然，用高压灭菌锅灭菌121 ℃，20 min，备用。

察氏液体培养基：硝酸钠3 g、磷酸氢二钾1 g、七水硫酸镁0.5 g、氯化钾0.5 g、硫酸亚铁0.01 g、蔗糖30 g、水1 000 mL。121 ℃，20 min灭菌备用。固体察氏培养基添加2%的琼脂。

1.2.2 菌株的筛选

用无菌水浸泡土霉素菌渣堆肥样品，得到的浸出液在察氏培养基平板上进行涂布，30 ℃下培养，获得菌落。

将察氏培养基上生长出的不同单菌落，分别在5%菌渣固体培养基上划线接种，在30 ℃条件下培养，分别获得M-1、M-2的单一菌落。

1.2.3 筛选菌株的生长曲线

制备孢子悬液：分别选择在察氏培养基上长势良好且孢子旺盛的M-1、M-2菌株，分别刮取孢子，用无菌水制成2.0×106个/mL的M-1和M-2的孢子悬液。

在装有100 mL察氏培养基的250 mL锥形瓶中，分别接入1 mL的M-1、M-2孢子悬液。每种菌做3组平行，每组13瓶。30 ℃、160 r/min摇床上培养。每隔12 h取出6瓶，5 000 r/min离心10 min，称量菌丝湿重，绘制生长曲线。

1.2.4 筛选菌株的酸、碱耐受性

分别配制pH值为2、3、4.5、6.5、7、8的100 mL/250 mL察氏培养基。分别接入1 mL的M-1、M-2的孢子悬液，每个梯度平行做3组，在30 ℃，160 r/min条件下培养6 d。5 000 r/min离心10 min，称量菌丝湿重，考察菌株的土霉素耐受性。

1.2.5 筛选菌株的土霉素耐受性

配制含有土霉素0、200、600、1 000、1 400和1 800 u/mL，pH 3的察氏液体培养基各100 mL，分别加入250 mL锥形瓶中。吸取1 mL的M-1、M-2的孢子悬液接入不同土霉素含量的察氏液体培养基中，在30 ℃，160 r/min条件下培养6 d。用5 000 r/min离心10 min，获得湿菌丝，称重，分析并比较土霉素对菌体生长的影响，考察其土霉素耐受性。

1.2.6 菌株产蛋白酶条件的优化

(1)菌株产蛋白酶活力的测定。以酪氨酸为标准物，Folin-酚试剂为显色剂，在660 nm处测定吸光值，绘制酪氨酸标准曲线，其回归方程式为y=127.22x-1.948 8，R2=0.997 4。

取一支试管，加入1 mL酪蛋白溶液(2%，pH 6.5磷酸盐缓冲液配制)，置入40 ℃水浴中预热5 min，再加入1 mL 40 ℃预热5 min的样品溶液，混匀后在40 ℃水浴中保温10 min。立刻加入2 mL 0.4 mol/L三氯乙酸，摇匀，保温20 min。离心，吸取上清液1 mL，加入5 mL的0.5 mol/L碳酸钠溶液，最后加入1 mL Folin-酚试剂，于40 ℃水浴中显色20 min。在660 nm波长下测吸光度。

酶活定义为在40 ℃，pH 6.5条件下，每分钟水解酪蛋白产生1 mg酪氨酸所需的酶量为1个酶活力单位(u)。

(2)菌株产蛋白酶条件的优化。为了优化产酶条件，以蛋白酶活力为依据，在察氏培养基中，对培养温度、pH值和培养时间进行研究。在菌渣培养基中，对菌渣添加量、接种量和装液量等因素进行研究。

1.2.7 筛选菌株对土霉素菌渣的转化

(1)菌渣整体质量的变化。在含有100 mL 5%菌渣液体培养基的250 mL锥形瓶中，分别加入8 mL的M-1、M-2的孢子悬液和无菌水，平行3组。在30 ℃、160 r/min条件下培养7 d。取出后在5 000 r/min条件下离心10 min，收集沉淀物。沉淀物在105 ℃条件下烘干至恒重，冷却后精确称量其重量。

(2)菌渣蛋白质含量的变化。培养方法同上。取出后在5 000 r/min条件下离心10 min，收集沉淀物。沉淀物在105 ℃条件下烘干至恒重，用凯式定氮法测定其蛋白含量。

(3)菌渣的游离氨基酸变化影响。培养方法同上。取出后在5 000 r/min条件下离心10 min，收集上清液，定容至一定体积，并测定其游离氨基酸含量。游离氨基酸的测定，以赖氨酸标准物，茚三酮为显色剂，在565 nm波长处测吸光值，得到回归方程式为y=304.74x+7.299 1，R2=0.999 1。

2 结果与分析

2.1 菌株的筛选

分离纯化获得两种霉菌，分别命名为M-1和M-2，菌落形态如下图。经初步鉴定M-1为米曲霉、M-2为绿色木霉。

图1 筛选菌株菌落形态

2.2 筛选菌株的生长曲线

将筛选菌株接种到液体察氏培养基中，培养一定时间后分别取样测定菌丝湿重，以菌丝湿重值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制生长曲线。由图2可见，培养开始24 h后，两种菌株的菌丝重量均急剧上升，此时菌种进入快速增长期。在72 h时，菌株M-1到达增长高点，随后菌丝湿重无明显变化，进入缓慢衰亡期；而菌株M-2在108 h时菌丝湿重达增长高点，随后进入衰亡期。

图2 筛选菌株生长曲线

2.3 筛选菌株的酸、碱耐受性

由图3可知，M-1和M-2分别在pH 3和pH 6.5表现出最佳的生长量，均呈现出良好的耐酸性。M-1耐酸性好于M-2。两种菌对碱性环境耐受性较差。

图3 pH值对菌体生长的影响

土霉素菌渣的pH在3.35到3.77之间呈酸性。两种霉菌都可以在样品的pH范围内生长，满足了处理土霉素菌渣的必要条件。

2.4 筛选菌株的土霉素耐受性

从图4可知，M-1土霉素耐受性好于M-2。土霉素浓度低于1 800 u/mL时，对两种霉菌的影响有限，两株霉菌可以在较高浓度的土霉素环境下均生长良好。菌渣里土霉素残留在416.6 u/mL左右，远低于1 800 u/mL的土霉素浓度，所以两种菌株在处理土霉素菌渣时，不会被土霉素抑制继而影响处理效率。

图4 土霉素浓度的变化对菌体生长的影响

2.5 菌株产蛋白酶条件的优化

2.5.1 培养基初始pH对菌株产蛋白酶能力的影响

向100 mL/250 mL察氏培养基中，分别接入1 mL M-1、M-2孢子悬液，初始pH值分别设定为5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5，平行3组，在30 ℃，转速为160 r/min条件下培养168 h，分别取样测定酶活，考察pH值变化对产酶活性的影响，结果如图5。

图5 初始pH对菌株产酶的影响

培养基初始pH值小于6.0时，菌株M-1和M-2均随着pH值的增大其产蛋白酶活力快速增加，pH值大于7.0时，随着pH值的增大其酶活力快速下降；菌株M-1在pH 6.0时，蛋白酶活力达到最高值，菌株M-1在pH6.5时其酶活达到最高。因此，菌株M-1和M-2产蛋白酶的最适初始pH值分别确定为6.0和6.5。

2.5.2 培养温度对菌株产蛋白酶能力的影响

向100 mL/250 mL察氏培养基中，分别接入1 mL M-1、M-2孢子悬液，pH值为 6.5，培养温度分别设置为25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃，平行3组。在转速为160 r/min条件下培养168 h，分别取样，测定酶活，考察温度的变化对产酶活性的影响，结果如图6。

图6 培养温度对菌株产酶的影响

在30 ℃以下培养时，菌株M-1和M-2产生蛋白酶活力随着温度的升高而增大，温度达到30 ℃时，它们酶活力均达到最高，而后随温度的提高酶活力下降。因此，菌株M-1和M-2产蛋白酶的最适温度确定为30 ℃。

2.5.3 培养时间对菌株产酶的影响

分别向100 mL/250 mL察氏培养基中接入1 mL M-1孢子悬液、1 mL M-2孢子悬液，pH值为6.5，平行3组。在30 ℃转速为160 r/min条件下培养192 h。每隔24 h分别取样测定酶活，考察培养时间对产酶活性的影响，结果如图7。

图7 培养时间对菌株产酶的影响

培养到48 h时，菌株M-1、M-2均开始产蛋白酶，培养至72 h时，酶积累量开始增大。在168 h时M-1产酶活力达到最高值，而M-2在144 h时酶活达到最高；在最高点之后，两种菌的产酶活性随之缓慢下降。因此，菌株M-1和M-2产蛋白酶的最适培养时间分别确定为168 h和144 h。

2.5.4 菌渣添加量对菌株产蛋白酶能力的影响

分别在100 mL/250 mL蒸馏水中加入5、10、15、20、25 g的400目土霉素菌渣粉末，分别向其中接入1 mL M-1、M-2孢子悬液，平行3组。在pH 6.5，转速为160 r/min，30 ℃条件下培养144 h，分别测定酶活，考察菌渣添加量对产酶活性的影响，结果如图8。

图8 菌渣添加量对菌株产酶的影响

菌渣添加量为5%～10%，M-1产蛋白酶的活力随菌渣添加量的增大而增加，10%达到最高。M-2产蛋白酶活力在5%时达到最高，在10%时也保持了较高的酶活力。随后，两种菌的酶活力随着菌渣添加量的增大而快速下降。在菌株M-1和M-2产蛋白酶的培养基中添加过多菌渣不利于其产生蛋白酶，这可能是菌渣中的一些成分影响了菌的产酶活性。所以，菌株M-1和M-2在菌渣培养基产蛋白酶的最适菌渣添加量分别确定为10%和5%。

2.5.5 接种量对菌株产蛋白酶能力的影响

在100 mL/250 mL 5%的菌渣培养基中，分别接种1、3、5、7和9 mL的M-1、M-2孢子悬液，平行3组。在pH 6.5，转速为160 r/min，30 ℃条件下培养144 h，分别取样测定酶活，考察接种量对产酶活性的影响，结果如图9。

图9 接种量对菌株产酶的影响

菌株M-1的产蛋白酶活力随接种量的提高而增加，直至接种量为5 mL时其酶活力达到最高值，随后其产酶活力逐渐下降，这可能是因为增加初始菌体的量导致菌体生长加快、发酵周期缩短。菌株M-2开始时，随着接种量的加大其蛋白酶活力逐渐增加。所以，菌株M-1和M-2在菌渣培养基中产蛋白酶的最适接种量分别确定为5%和9%。

2.5.6 装液量对菌株产蛋白酶能力的影响

在250 mL的锥形瓶中分别加入5%的菌渣培养基20、40、60、80和100 mL，分别按照5%和9%的接种量接入M-1、M-2的孢子悬液，平行3组。在pH 6.5，转速为160 r/min，30 ℃条件下培养144 h，分别取样测定酶活，考察装液量对产酶活性的影响，结果如图10。

图10 装液量对菌株产酶的影响

菌株M-1在装液量低于40 mL时，其产生蛋白酶活力随装液量的加大而增加，在装液量为40 mL时酶活达到最高，而后其酶活下降。菌株M-2的产蛋白酶活力随着装液量的增加而逐渐提高。所以，在250 mL锥形瓶中，M-1、M-2的最佳装液量确定为40 mL和100 mL。

2.6 菌株在优化菌渣培养条件下的产蛋白酶活力测定

M-1的优化培养条件：在250 mL锥形瓶中，40 mL装液量，10%菌渣添加量，5%接种量，pH值6.0，30 ℃，摇床转速160 r/min培养168 h；M-2的优化培养条件：在250 mL锥形瓶中，100 mL装液量，5%菌渣添加量，9%接种量，pH值6.5，30 ℃，摇床转速160 r/min培养144 h。发酵结束后，测定蛋白酶活力。结果见表1。

表1 筛选菌株产蛋白酶活力

在菌渣培养基中，菌株M-2在其最适产酶条件下，发酵上清液中蛋白酶活为44.41 u/mL，菌株M-1在其最适产酶条件下产蛋白酶活性达到99.33 u/mL，比菌株M-2的高出1.24倍。

2.7 筛选菌株对土霉素菌渣的转化

筛选菌株对菌渣成分的转化研究中，共考察了菌渣总重量、蛋白成分的变化和发酵后游离氨基酸的变化等内容，结果见表2。

表2 菌渣活性成分的变化

菌株M-1和M-2在菌渣培养基中进行发酵时，对菌渣成分能够有效转化；其中M-1对总物质的转化率达到6.21%，其中对菌渣蛋白质成分转化尤为明显达到12.79%；菌渣经M-1发酵处理后其游离氨基酸含量有明显的提升，由原来7.14 mg增加到222.07 mg，提高了30倍。结果表明，筛选菌株M-1在简单的菌渣培养基中能很好地生长，而且对菌渣蛋白质有较好的水解和转化活性。菌株M-2对菌渣总物质的转化率达到2.4%，对菌渣蛋白质成分转化达到3.65%，菌渣经M-2发酵处理后其游离氨基酸含量有较好的提升，由原来7.14 mg增加到49.26 mg，提高了6倍。经M-1处理后的菌渣所减少的质量大部分是蛋白质被转化所致，而M-2处理后的菌渣减少的质量部分是转化蛋白质，另外一部分是被水解的其他物质减少的量。

3 结论

本实验筛选出两株M-1、M-2，经初步鉴定M-1为米曲霉菌，M-2为绿色木霉菌。M-1在pH 3、M-2在pH 6.5时生长量最大，均表现出良好的酸耐受性。两株霉菌在土霉素浓度1 800 u/mL的条件下生长良好，具有较好的土霉素耐受性。菌渣pH值及土霉素残留量对其生长没有抑制作用，适合应用于土霉素菌渣的处理[12]，对碱性环境耐受性较差。两株霉菌对处理菌渣是有效的，M-1的处理效果好于M-2。M-1对菌渣蛋白质成分的转化率达到12.79%，游离氨基酸含量提高了30倍；菌渣经M-2发酵处理后其游离氨基酸含量提高了6倍。

筛选菌株可在酸性的菌渣环境中生长，可对生产菌渣进行发酵处理，可以得到蛋白质水解液，用水解液部分替代土霉素生产发酵培养基的碳、氮源进行生产土霉素，可降低生产成本；同时达到菌渣的回收利用和无害化处理目的。对含大量抗生素残留、成分复杂、难降解的危险污染物菌渣，目前还缺乏高效、节能、环境友好型的处理方法。土霉素菌渣中的蛋白质含量可达到43.88%，利用两株霉菌生长及代谢的不同，如果实现两种菌株的混合培养，作为互补进而加强对菌渣的处理能力，对危险菌渣的无害化处理及资源的再利用方面具有重大价值[13]，这有待进一步研究。