HA基因真核表达载体构建及在293T细胞中的表达

李方琳，王慧慧，粟雨芯，马忠仁*

（1.西北民族大学 生物医学研究中心，甘肃 兰州 730030；2.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030）

人流行性感冒（流感）是由流感病毒引起的急性呼吸道传染性疾病。据世界卫生组织估计，流感病毒每年感染率高达5%～10%，老年人是高危人群[1-2]。因此，流感在威胁公共健康的同时，也增加了国家和社会的经济负担[3]。血凝素（Hemagglutinin,HA）和神经氨酸酶（Neuraminidase,NA）是流感病毒2种表面抗原，其抗原性强，容易变异，致使人群对新毒株的免疫力下降，给疫苗研制与生产带来了挑战[4]。目前，接种流感疫苗是预防和控制流感最为有效的措施，及时接种流感疫苗，既能减少流感病毒感染，又能减轻流感症状[5]。DNA疫苗因其免疫效果好、危险性低、价格低廉、易于贮藏和运输等优点受到广泛关注[6-9]。近年来，流感病毒的DNA疫苗研究取得了较大进展。针对人流感分离株H5N1的DNA疫苗研究结果表明，该研究中所构建的H5N1的DNA疫苗能够诱导小鼠产生免疫反应[10]。此外，有学者已经成功构建出2013年暴发的禽流感的病原体H7N9的DNA疫苗[11]。本试验旨在构建甲型流感病毒（H1N1）血凝素（HA）的pcDNA3.1(+)真核表达质粒（pcDNA3.1(+)-HA），为后续其作为DNA疫苗免疫实验动物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

人肾上皮细胞系（293T）由西北民族大学生物医学研究中心冻存传代；E.coli BL21感受态细胞由西北民族大学生物工程与技术实验室制备；引物由杨凌天润奥科生物科技有限公司合成，荧光定量内参为GAPDH。

1.2 主要试剂

DL10000 Marker、DL2000 Marker、限制性内切酶BamH I和Xho I均购于TAKARA生物技术有限公司；聚合酶链式反应（PCR）试剂（北京博奥龙免疫技术有限公司），TreliefTM SoSoo Cloning Kit（北京擎科生物技术有限公司），胎牛血清（兰州民海生物工程有限公司），DMEM高糖培养基（兰州百灵生物技术有限公司），转染试剂（Invigentech公司）；总RNA提取试剂（上海雅酶生物医药科技有限公司），反转录及荧光定量试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）；β-Actin、抗甲型流感H1N1 HA抗体（兔源，Abcam)；山羊抗兔IgG抗体（HRP标记，Abcam）。

1.3 方法

1.3.1 目的基因的扩增与连接 采用PCR技术，以H1N1流感病毒cDNA为模版，上游引物为5’-TGGAAATGGCTGCTTCGAGT-3’、下游引物为5’-TTGCCTCCTCGCTGTACTTG-3’，扩增目的基因大小为1 700 bp左右。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，进行回收与纯化。

用限制性内切酶BamH I和Xho I按表1反应体系酶切pcDNA3.1(+)质粒和目的基因，经琼脂糖凝胶电泳、纯化、回收线性载体和目的基因后，用TreliefTM SoSoo Cloning Kit进行连接。连接产物即重组质粒命名为pcDNA3.1(+)-HA。将连接产物转化至BL21感受态，37 ℃、200～220 rpm放大培养，抽提质粒后进行双酶切验证。

表1 双酶切反应体系（20 μl）

1.3.2 质粒转染及荧光定量 293T细胞由含10%胎牛血清的DMEM高糖完全培养基，于37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中培养。转染前培养于6孔板中，当细胞密度达60%左右时，使用Invigentech公司转染试剂按照操作说明书将pcDNA3.1 (+)与成功构建的pcDNA3.1 (+)-HA重组质粒分别与转染试剂按照1∶1混匀，混合液于室温孵育10～15 min后，加入含有完全培养基的293T细胞中培养24 h后，换液培养至48 h，其中以不转染细胞作为空白对照组，pcDNA3.1 (+)转染为阴性对照组。随后提取细胞RNA并反转录，通过荧光定量观察HA基因在293T细胞中的mRNA相对表达情况。

1.3.3 蛋白免疫印迹（Western blot）检测HA的表达 各组质粒转染48 h后，经PBS清洗数次，收集细胞并加入RIPA裂解液500 μl（含有1%的PMSF），抽提蛋白。用BCA法定量，经SDSPAGE凝胶电泳后用湿转的方法转移到PVDF膜上，封闭后，孵育一抗，二抗4 ℃过夜孵育后，显影拍照并保存。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增与重组质粒鉴定

设计引物进行PCR扩增，扩增片段大小为1 700 bp左右，与预期大小相符（图1A）。重组质粒经BamH I和Xho I酶切后，电泳结果出现1 700 bp的目的条带（图1B）。结果表明pcDNA3.1 (+)-HA重组质粒构建成功。

图1 HA PCR产物电泳及pcDNA3.1 (+)-HA双酶切

2.2 HA基因mRNA表达水平

将质粒转染293T细胞48 h后的荧光定量结果显示，与对照组相比，转染后293T细胞内HA的mRNA表达显著上升（P＜0.000 1，图2），这一结果也进一步表明pcDNA3.1 (+)-HA重组质粒构建成功并且能在293T细胞中表达。pcDNA3.1 (+)-HA转染组HA的mRNA表达水平显著高于空白对照及空载转染组（P＜0.000 1，图2）。

图2 pcDNA3.1 (+)-HA转染293T细胞后HA mRNA表达

2.3 Western blot验证pcDNA3.1 (+)-HA在293T细胞中的蛋白表达

转染293T细胞48 h提取蛋白，经Western Blot检测HA蛋白的表达。图3表明，转染pcDNA3.1 (+)-HA重组质粒组，出现特异性条带，即HA蛋白，而未转染及空载组无条带，与mRNA水平一致（图2），说明真核表达载体pcDNA3.1 (+)-HA转染293T细胞后，细胞内HA蛋白的表达明显增加。

图3 Western Blot检测pcDNA3.1 (+)-HA转染293T细胞后HA的蛋白表达

3 讨论与结论

甲型流感病毒传染性较强，容易形成大流行。HA是流感病毒表面主要的结构蛋白之一，也是甲型流感病毒主要的表面抗原，它能产生保护人类的中和抗体[12]，因此是疫苗开发的靶点[13]，也是DNA疫苗的聚焦点。重组质粒是研究基因功能的常用手段之一，也是DNA疫苗的主要技术。DNA疫苗作为新兴的生物技术产品已被充分肯定，应用前景较好。

为了进一步研究DNA疫苗的免疫效果，本研究通过P C R 等技术成功构建重组质粒pcDNA3.1 (+)-HA，验证后将其转染293T细胞，48 h后对细胞内HA进行mRNA及蛋白水平检测。结果表明，转染后细胞内无论是mRNA水平，还是蛋白表达水平都显著增加，证明成功构建真核表达载体pcDNA3.1 (+)-HA，可为后续DNA的研究提供材料。