样品不同运输时长对小反刍兽疫病毒抗体检测结果的影响

洛松西热，王玉恒，吉哈利，于子淇，胡剑武，旦增卓玛

（1.西藏自治区兽医生物药品制造厂，西藏 拉萨 850000；2.西藏自治区兽医局，西藏 拉萨 850000；3.西藏莲茎生物科技有限公司，西藏 拉萨 850000）

西藏自治区位于青藏高原西南部，动物资源尤为丰富，其中大中型野生动物数量居全国第一。养殖牛羊可为西藏农牧民带来经济收入，但小反刍兽疫、牛结节性皮肤病等重大动物疫病会影响养殖效益，因此进行动物疫病抗体检测尤为重要[1]。目前酶联免疫吸附试验（ELISA）是动物疫病抗体的主要检测方法。血清抗体是一种免疫蛋白，其蛋白质量会直接影响动物疫病抗体检测结果的准确性[2]。由于西藏地广、道路崎岖、养殖户分散等原因，导致样品运输时间相对较长，有可能会影响抗体检测结果[3-5]。目前，传统样品运输方式为泡沫箱加冰袋，这种方法虽然便捷，但受外围环境影响有一定时限性，可能会对血清抗体检测结果造成一定影响[6-8]。因此，探究泡沫箱的保温效果及其对血清检测结果的影响尤为重要。

本试验模拟不同运输温度，采用传统运输方式探究泡沫箱内温度变化以及保存时长对小反刍兽疫病毒抗体检测结果的影响，为动物疫病检测工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

小反刍兽疫活疫苗（Clon9株）由西藏自治区兽医生物药品制造厂提供，批号 202101；小反刍兽疫竞争ELISA抗体检测试剂盒采购于青岛立见生物科技有限公司，批号20172107。

1.2 主要仪器

酶标分析仪采购于北京普朗新技术有限公司，型号DNM-9602；恒温培养箱采购于上海鸿都科技有限公司，型号SHP-300；高速冷冻离心机采购于湖南星科科学仪器有限公司，型号TGL16；4 ℃冰箱采购于海尔集团，型号BCD-223WDPT；温度计经深州天溯计量检测股份有限公司校验，校验证书编号Z20211-G208274，其他耗材均为国产。

1.3 样品来源

试验动物为20头2～3月龄的西藏本地山羊，按照小反刍兽疫疫苗免疫剂量说明书进行颈部皮下免疫。免疫21 d后，颈静脉采全血10 ml，4 ℃ 10 000 r/min，5 min分离血清。将10份血清样品分装为3份，保存于1.5 ml离心管。

1.4 试验方法

1.4.1 试验设计 本试验共设3个试验组，分别为4 ℃试验组、25 ℃试验组、37 ℃试验组。在3个泡沫箱（内尺寸250 mm×110 mm×130 mm；外尺寸300 mm×140 mm×230 mm）中分别放入10份山羊血清样品和3个冰袋（约300 g），放置于37 ℃恒温培养箱、25 ℃恒温培养箱和4 ℃冰箱。将温度计插入泡沫箱内，定期观察温度变化。

1.4.2 抗体检测方法 在血清样品放置0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h后，分别取出少量血清用于抗体检测。根据小反刍兽疫病毒抗体检测试剂盒说明书进行操作。先在阴性对照孔、阳性对照孔和空白对照孔各加入50 μl阴、阳性对照样品和样品稀释液，样品检测孔加入25 μl样品稀释液和25 μl血清样品，震荡混匀，37 ℃孵育60 min，每孔加入300 μl洗涤液，洗涤4次。然后每孔加入50 μl酶标抗体，37 ℃孵育30 min，再加入300 μl洗涤液，洗涤4次，再加入50 μl底物溶液，室温避光孵育15 min。最后每孔加入50 μl终止液，于450 nm波长处测定各孔吸光值。

1.4.3 抗体检测判定方法 标准样品判定：阳性对照样品抑制率（PI）=（1-阳性对照孔吸光值/空白对照孔吸光值）×100%＞60%；阴性对照样品抑制率（PI）=（1-阴性对照孔吸光值/空白对照孔吸光值）×100%＜40%；结果判定：样品抑制率（PI）=（1-待检样品吸光值/空白对照孔吸光值）×100%，PI＞50%为阳性，PI≤50%为阴性。

1.5 数据分析

应用Microsoft Excel 2010版软件对试验羊的血清样品抗体水平进行分析，统计数据用平均数±标准差（Mean±SD）表示。

2 结果

2.1 不同环境温度对泡沫箱内的温度影响

2.1.1 4 ℃环境温度对泡沫箱内的温度影响 由图1可知，当环境温度为4 ℃时，泡沫箱内温度变化趋势较平缓，其中在16～20 h泡沫箱内温度维持在最低温度（1 ℃），在56 h达到最高温度（5 ℃），其余时间段均维持在2～4 ℃。

图1 4 ℃时泡沫箱内的温度变化

2.1.2 25 ℃环境温度对泡沫箱内的温度影响 由图2可知，当环境温度为25 ℃时，泡沫箱内温度变化趋势为阶段性升高，其中在4～40 h泡沫箱内温度维持在9～12 ℃，在40～56 h泡沫箱内温度上升至20 ℃，在56～72 h泡沫箱内温度维持在22～25 ℃。

图2 25 ℃时泡沫箱内的温度变化

2.1.3 37 ℃环境温度对泡沫箱内的温度影响 由图3可知，当环境温度为37 ℃时，泡沫箱内温度变化趋势为对数性升高，其中在4～20 h泡沫箱内温度升高至20 ℃，在24～40 h泡沫箱内温度升高至30 ℃，在40～72 h时泡沫箱内温度升高至38 ℃。

图3 37 ℃时泡沫箱内的温度变化

2.2 标准样品检测结果

由表1可知，阳性对照组抑制率（PI）为88.59%＞60%，阴性对照组抑制率（PI）为4.52%＜40%。根据样品判定标准可知，本次试验的阳性对照和阴性对照成立，进一步表明可根据试剂盒内结果判定标准对检测血清样品进行判定。

表1 阳性对照组和阴性对照组检测结果

2.3 不同运输时长对抗体检测结果的影响

由表2、表3可知，运输时长为12 h时，4 ℃试验组、25 ℃试验组和37 ℃试验组的平均吸光值均维持在0.025，平均阻断率（PI）均为80%；运输时长为24～36 h时，4 ℃试验组和25 ℃试验组的平均吸光值和平均阻断率相差不大，但均比37 ℃试验组的平均阻断率低2%～3%；运输时长超过48 h时，4 ℃试验组的平均阻断率基本稳定，但25 ℃试验组和37 ℃试验组的平均阻断率均下降2%～5%。

表2 不同运输时长对样品吸光值的影响

表3 不同运输时长对样品阻断率的影响

3 讨论

在小反刍兽疫、牛结节性皮肤病等动物疫病的流行下，对牛羊等动物抗体效价检测尤为重要[1]。只有评估抗体效价才能真正监控牛羊等动物群体的免疫动态。由于温度、时间等运输条件会对血清样品质量造成一定影响[2-5]，所以对运输条件的探索有重要意义。本试验模拟4 ℃、25 ℃和37 ℃外界环境条件，探索泡沫箱内温度变化。结果显示当环境温度为4 ℃时，泡沫箱内温度变化趋势较平缓；当环境温度为25 ℃时，泡沫箱内温度变化趋势为阶段性升高，在56～72 h泡沫箱内温度维持在22～25 ℃；当环境温度为37 ℃时，泡沫箱内温度变化趋势为对数性升高，在24～40 h泡沫箱内温度升高至30℃，在40～72 h泡沫箱内温度升高至38 ℃。结果表明，外界温度为4 ℃时，泡沫箱内温度会维持在6 ℃以下；外界温度为25 ℃时，在24 h内泡沫箱内温度会维持10 ℃以下；外界温度为37 ℃时，在8 h内泡沫箱内温度会维持15 ℃以下，进一步表明外界环境温度与泡沫箱内温度密切相关。利用酶联免疫吸附试验检测不同运输时长对血清抗体水平的影响，结果表明随着运输时长的增加，4 ℃试验组的平均吸光值和平均阻断率基本维持不变；在运输时长超过48 h时，25 ℃试验组的平均阻断率会降低2%～3%；运输时长超过24 h时，37 ℃试验组的平均阻断率会降低2%～5%。不同运输时长对血清抗体检测结果充分表明，泡沫箱加冰袋的传统运输方法运输血清样品时，运输时长不宜超过12 h，才能保证检测结果的准确性。