肝豆状核变性家系ATP7B基因错义和同义突变

王建文，常 乐，谷 涛，李东初，王珍珍，陈桂生

肝豆状核变性(HLD)，又名威尔逊病(WD),1912年，英国神经学家威尔逊首次报道，ATP7B基因突变是直接原因，该基因的突变导致循环中铜量的增加[1]，使其沉积在中枢神经系统、肝脏及角膜[2]，引起肝功能、神经功能缺损及角膜K-F环。其发病年龄存在显著差异，在3岁及80岁均有病例报道[3]，由于临床症状的多样性以及基因的不完全外显性，往往导致误诊甚至漏诊，据报道平均延迟诊断4年[4]。目前对于症状前患者，ATP7B基因测序可能是唯一诊断的工具。近年来，随着第二代DNA测序技术的发展，越来越多的错义和同义突变被相继报道，正确识别同义突变对疾病的早期诊断、治疗及预防具有重要意义。最近,Wang等人[5]研究表明,同义突变c.4014T>A和错义突变R919G，可导致ATP7B基因转录本中外显子跳跃，形成截断的蛋白质，进一步提高了对WD发病机制的认识。本研究分析了一例临床诊断肝豆状核变性患者，对先症者及其家系内成员ATP7B基因进行了测序，探讨突变位点的临床意义，分析了致病基因在该家系的遗传规律。

1 资料与方法

1.1 一般资料:选取2020年4月就诊于宁夏医科大学总医院神经内科门诊的1例以“头部不自主抖动”为首发症状的青年女性患者，评估临床症状，完善铜生化检测及颅脑磁共振，根据莱比锡评分[6]临床诊断WD，对先证者及其家系内成员(母亲、同胞及其先证者子女，本研究中对先证者妹妹，根据年龄大小，分别为大妹及小妹)进行ATP7B基因测序。因患者父亲去世，未完成基因测序，其父亲死亡原因为急性心肌梗死，生前无WD相关临床症状。本研究根据是否出现临床症状，绘制系谱图。

1.2 研究方法:根据赫尔辛基宣言，征得患者及其家属同意后，签署知情同意书，并经宁夏医科大学伦理委员会批准后，采用第二代DNA测序方法，对先证者、母亲及小妹行ATP7B基因直接测序，对患者大妹、弟弟及患者子女行候选突变位点验证。

1.2.1 ATP7B基因测序:充分告知患者及家属后，给予EDTA抗凝采血管采集研究对象外周静脉血5 mL，-20 ℃保存，送至宁夏金域医学检验所，通过nexSeq 500及PCR仪ABI9700完成测序。本方法仅能检测到外显子编码区及内含子-外显子交界处突变，可能漏检约2%的突变。PCR产物采用Ampure磁珠进行纯化，并进行Qubit定量，取捕获后的DNA样本进行Illumina NovaSeq高通量测序。测序数据经Illunina Sequence Control Software(SCS)评估合格后，进行数据读取和生物信息学分析。

1.2.2 候选位点Sanger测序:对候基因行Sanger测序，见表1，验证其准确性。

表1 ATP7B基因候选突变位点外显子引物序列

1.2.3 预测候选突变位点蛋白质功能:根据生物信息学分析，错义突变使用PolyPhen-2、SIFT完成突变位点蛋白质功能预测；同义突变可能影响剪接位点，使用dbscSNV软件完成突变位点预测。

1.2.4 根据ATP7B基因测序校正家系系谱图:根据ATP7B基因测序结果，明确研究对象是否存在基因突变。

2 结果

2.1 ATP7B基因测序:先证者ATP7B基因Exon8 c.2333G>T p.(Arg778Leu) 错义杂合突变，导致778位鸟嘌呤(G)改变为胸腺嘧啶(T),致精氨酸(Arg)改变为亮氨酸(Leu)；Exon14 c.3243G>A p.(Glu1081=) 同义杂合突变，导致3243位鸟嘌呤(G)改变为腺嘌呤(A),编码的谷氨酸未发生变化(参考序列NM_000053.3)，其小妹存在相同突变；其母亲存在Exon8 c.2333G>T p.(Arg778Leu) 错义杂合突变，导致778位鸟嘌呤(G)改变为胸腺嘧啶(T),致精氨酸(Arg)改变为亮氨酸(Leu)(参考序列NM_000053.4)，其弟弟存在相同突变；其女儿存在Exon14 c.3243G>A p.(Glu1081=) 杂合突变，导致3243位鸟嘌呤(G)改变为腺嘌呤(A),编码的谷氨酸未发生变化(参考序列NM_000053.3)，其儿子及大妹具有相同突变。家系内具体突变位点见表2。

表2 研究对象ATP7B基因检测结果

2.2 Sanger验证结果:根据测序结果，对突变位点进行Sanger测序验证，与测序结果一致，具体见图1-图4(封二)。

2.3 候选突变位点蛋白质功能预测:针对候选突变位点，使用PolyPhen-2及SIFT，预测错义突变c.2333G>T p.(Arg778Leu)的致病性，PoPolyPhen-2预测其突变可能带来的损害得分为1.000，敏感度为0，特异性为1；SIFT提示该变体得分为-5.644分，该系统默认阈值为-2.5分，分数等于或低于-2.5分，有损害；使用dbscSNV对c.3243G>A P.(Glu1081=)预测致病性，该软件两种算法分别得分为0.992及0.956，该预测软件结果分析大于0.6提示影响mRNA剪接，结果越趋近于1，可能性越大。

2.4 校正家系遗传系谱:本研究先证者及其小妹均出现WD临床表现，先证者母亲、大妹、弟弟、儿子及其女儿均无相关临床表现，但通过ATP7B基因测序，先证者及其小妹均存在两个突变，确诊为WD患者；其余研究对象均存在一个突变位点，为携带者，无相关临床表现。

3 讨论

肝豆状核变性(WD)是一种由ATP7B基因突变引起的常染色体隐性疾病[4]，由于ATP7B在肝脏中表达丰富，是铜积累的主要部位[7]。目前WD的诊断主要根据临床症状、相关辅助检查及ATP7B基因综合确诊,但对于有家族史患者，突变位点分析是无症状及症状前阶段诊断的唯一方法。结合本研究中的家系特点，患者二妹19岁以双下肢不自主抖动起病，未完善基因检测。10余年后其姐，也就是本研究中先证者因头部不自主抖动就诊，通过家系内ATP7B基因测序，发现其母亲存在1个突变位点，呈杂合型，为致病基因的携带者，无临床表型；先证者及其小妹均存在2个突变位点，呈隐形纯合体，均确诊为患者。但在该家系内其大妹、子女均检出一处杂合同义突变，表现为无临床表型携带者。在本研究中，未能进行患者父亲基因测序，但根据家系内成员测序结果，我们认为c.3243G>A突变来源于父亲，回顾家系内测序结果符合常染色体隐性遗传规律。

目前，ATP7B基因是唯一明确的WD致病基因，大多数患者是ATP7B致病突变为纯合子或复合杂合子，致病突变主要包括错义、无义、小缺失、小插入和剪接变异体[8]。随着第二代DNA基因测序技术的发展，越来越多临床意义不确定的变异被检测出来[9]，其中同义突变占有相当大的比重，人们逐渐认识到，剪接序列以外的剪接错误是一类重要的致病机制，尤其是在隐性遗传性疾病中。本研究中，先证者具有c.2333G>T p.(Arg778Leu) 杂合错义突变和Exon14 c.3243G>A p.(Glu1081=) 杂合同义突变。p.(Arg778Leu)是亚洲人最常见的突变位点，我们使用生物分析工具预测其存在致病性。针对同义突变，该位点于2019年在中国北方汉族人口中首次报道[10]，本研究中，我们首次在回族家系内检测到相同突变，为进一步明确该位点临床意义，我们使用dbscSNV分析工具，其两种算法预测分数均大于0.6，表示此突变位点影响mRNA剪接的可能性大，拟进一步行体外验证实验，但在最近的研究中，Zhou等人[9]研究表明，c.3243G>A)突变位点导致Exon14完全跳跃，阻碍正常的mRNA剪接，进一步提供了可靠的实验依据。

同义突变通常被认为是沉默突变，因不引起编码氨基酸的变化，往往被人们所忽视。但近年来的研究表明，脊髓肌萎缩症[5]等多种疾病可能是通过外显子跳跃而致病。本研究中，c.3243G>A位于外显子14的最后一个碱基[9]，通过破坏剪接调节元件(SREs)而导致mRNA的异常剪接，引起外显子跳跃，但具体机制有待进一步研究，所以外显子的跳跃可能是该家系致病的另一种机制。

对于常染色体隐性遗传，受孕个体50%的概率为无症状的携带者，WD患者其后代罹患该病存在0.5%的风险[11]。本研究中，家系内成员均检测到突变位点，其子女为无症状携带者，在未来的遗传中，应再次避免携带者，降低家系内患病人数。我们在临床诊疗过程中发现ATP7B突变位点，须对其亲属进行基因筛查，并进行产前检测和孕前基因检测，以减少威尔逊病传播的风险。