低浓度二硫苏糖醇处理红细胞消除抗CD38单抗 对输血前相容性试验的干扰 ——附2例多发性骨髓瘤病例检测结果报告

张永丽

作者单位：226400 江苏南通，如东县人民医院输血科

多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是以克隆性浆细胞异常增殖为主要表现的恶性血液系统疾病［1］，MM患者浆细胞异常增生，分泌大量单克隆免疫球蛋白（M蛋白）或本周氏蛋白（Bence Jones蛋白，游离的单克隆性κ或λ轻链）。MM发病率在造血系统恶性肿瘤中排名第二，发病人数约为造血系统恶性肿瘤患者总数的10%［2］。MM患者的中位生存期约为3～4年，该疾病危害较大。CD38抗原在骨髓瘤细胞中高表达，目前临床常用抗CD38（通用名达雷妥尤单抗）治疗MM，CD38抗原在正常人群的红细胞中低表达，因此抗CD38会对任何基于抗人球蛋白试剂的检测方法产生干扰，且进行一次 抗CD38治疗后，干扰将长期存在。如东县人民医院收治2例使用抗CD38治疗的MM患者，通过多次试验寻找二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）的最低浓度，使其既能消除抗CD38干扰，还可保留其他红细胞系统抗原，防止发生不规则抗体漏检，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 病例资料

1.1.1 病例1 本院血液科住院患者，男性，70岁，2020年无明显诱因出现泡沫尿，同年12月出现右侧肋骨、右侧肩胛骨、左侧髋关节疼痛。2020年 12月—2021年1月先后在南通市肿瘤医院和苏州大学第一附属医院就诊，诊断为MM，且进行多次VRD-Lite方案化疗，期间多次输血，未出现配血困难现象。患者因化疗效果不佳，与2021年4月14日 改为PD化疗方案，在化疗第1天、第8天、第15天、第22天使用抗CD38单抗1000 mg治疗。2021年 7月21日患者因病情加重，转至本院血液科住院治疗，检测血红蛋白（hemoglobin，Hb）47 g/L,主治医生开具输血申请单至输血科。

1.1.2 病例2 本院重症监护病房（intensive care unit，ICU）住院患者，女性，59岁，诊断为MM 5年余，于2021年10月复发，在南通大学附属医院血液科治疗，治疗期间使用抗CD38治疗，具体用药方案家属不能准确描述。3 d前住院期间病情加重，遂自行出院，于12月1日转入本院ICU，初步诊断为1型呼吸衰竭、急性肾损伤、MM、骨和骨髓继发性恶性肿瘤。12月3日查Hb为67 g/L，主治医生开具输血申请单至输血科。

1.2 试剂与仪器 ABO、RhD血型定型检测卡（批号：20210202、20210501），ABO血型反定型试剂红细胞（批号：2021070101、2021090301），抗人球蛋白检测卡（用于抗体筛查，批号：20210101、20210503）， 不规则抗体筛选试剂红细胞1（批号：20210403），不规则抗体筛选试剂红细胞2（批号：20210603），不规则抗体筛选试剂红细胞3（批号：20210901），不规则抗体筛选试剂红细胞4（批号：20211101），抗人球蛋白检测卡（用于交叉配血，批号：20210301），以上试剂均为长春博迅生物制品有限公司产品。木瓜酶、DTT为德国BioFroxx公司产品，配制成1.0%木瓜酶试剂和0.2 mol/L DTT试剂。FYQ型试剂卡孵育器，TD-A型血型血清学用离心机购自长春博研科学仪器有限责任公司。SC-2546型低速离心机购自安徽中科中佳科学仪器有限公司。

1.3 试验方法 对患者常规进行ABO、RhD血型鉴定、抗人球蛋白检测卡交叉配血，配血不合则加做不规则抗体筛查试验（盐水法和抗人球蛋白检测卡法），不规则抗体筛查试验阳性则加做不规则抗体鉴定试验，同时加做直接抗人球蛋白试验以及自身对照。获得试验结果后，向临床询问病史以及用药史，获悉为MM患者，且使用过抗CD38治疗。根据《CD38单克隆抗体对输血相容性检测干扰及其应对方案的专家共识》［3］，采用木瓜酶二步法，使用DTT处 理不规则抗体筛选红细胞和献血员红细胞后再次进行抗体筛查试验和抗人球蛋白检测卡交叉配血试验。

1.3.1 木瓜酶二步法 参考文献［4］，1.0%酶工作液与洗涤红细胞按1∶1比例混合，37 ℃孵育10 min， 至少洗涤3次，制备成浓度为0.8%～1.0%的红细胞悬液，使用酶处理的红细胞进行不规则抗体筛查试验和抗人球蛋白检测卡交叉配血试验。

1.3.2 DTT处理红细胞 操作步骤参考文献［5］，不同浓度的DTT和PBS洗涤的压积红细胞以4∶1比例混合，37 ℃孵育40 min，每5 min混匀1次，使用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）洗涤4次，用PBS配制成浓度为0.8%～1.0%的红细胞悬液，用DTT处理的红细胞进行不规则抗体筛查试验和抗人球蛋白检测卡交叉配血试验。

2 结果

2.1 血型 病例1：ABO血型B型，正反定型相符，Rh（D）阳性。病例2：ABO血型A型，正反定型相符，Rh（D）阳性。

2.2 交叉配血 病例1：抗人球蛋白检测卡交叉配血不合，主侧2+，次侧阴性。病例2：抗人球蛋白检测卡交叉配血不合，主侧2+，次侧阴性。

2.3 不规则抗体筛查试验、自身对照、直接抗人球试验 病例1：不规则抗体筛查试验结果可见，盐水法阴性，抗人球蛋白检测卡法阳性，见图1A；两批次6个谱细胞凝集强度均为2+；自身对照阴性，直接抗人球蛋白试验阴性。病例2：不规则抗体筛查试验结果可见，盐水法阴性，抗人球蛋白检测卡法阳性；两批次6个谱细胞凝集强度均为2+；自身对照阴性，直接抗人球蛋白试验阴性。

2.4 木瓜酶二步法 木瓜酶处理不规则抗体筛选红细胞和献血员红细胞后，再进行不规则抗体筛查试验。抗人球蛋白检测卡法依旧为阳性，2例患者4批次12个谱细胞凝集强度均为2+，抗人球蛋白检测卡交叉配血试验结果仍为不合，主侧凝集强度2+，次侧阴性。

2.5 DTT处理不规则抗体筛选红细胞和献血员红细胞 分别采用浓度为0.200 mol/L、0.020 mol/L、0.002 mol/L、0.005 mol/L的DTT处理不规则抗体筛选红细胞和随机10个ABO同型献血员红细胞后，进行不规则抗体筛查试验，采用抗人球蛋白检测卡法和抗人球蛋白检测卡交叉配血，结果均为阴性。见图1B～1C。

图1 DTT处理前以及0.002 mol/L、0.005mol/L DTT处理后抗体筛查结果

3 讨论

MM是浆细胞恶性增殖性血液系统疾病，发病率约为（1～2）/10万，MM患者数约占血液系统恶性肿瘤患者总数的10%，多见于中老年，男性患者多于女性。临床上常见的MM有免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）型、免疫球蛋白A（IgA）型和轻链型，其中轻链型MM相较于前两者，由于总蛋白（total protein，TP）、球蛋白（globulin，GLB）水平正常，Ig水平正常或降低，容易漏诊或误诊［6］。由于浆细胞恶性增生、骨髓广泛浸润和大量单克隆Ig的出现和沉积，从而引起溶骨性骨骼破坏、贫血、高钙血症、肾功能不全等临床表现（即“CRAB”症状）［7］。约50%的MM患者因贫血待查和全血细胞减少首诊于血液科，首诊症状以骨痛、腰椎痛多见，骨痛合并肾功能不全者次之［8］。MM的治疗以温和性化疗为主，患者中位生存期为3～4年。

CD38抗原是一个相对分子质量为45000的单链跨膜糖蛋白，整体结构分为N末端短的细胞质尾，单次跨膜域和C段长的胞外区［9］。CD38抗原作为受体还参与细胞黏附与跨膜信号转导过程。CD38抗原在正常淋巴细胞、骨髓来源细胞和一些非造血组织中表达较低，而淋巴细胞和骨髓来源的血液恶性肿瘤则过度表达CD38抗原，因此CD38抗原是理想的免疫治疗靶点。抗CD38以CD38为靶抗原，通过补体依赖性细胞毒性作用、抗体依赖性细胞毒性作用和凋亡等多种机制，清除表达CD38分子的肿瘤细胞［10］，联合来那度胺、地塞米松治疗MM的应答率达到58.3%，为复发及难治性骨髓瘤患者带来了希望［11］。因此抗CD38单抗可作为治疗难治性MM的推荐用药。人红细胞较骨髓瘤细胞低表达CD38，抗CD38单抗也可与红细胞上的CD38抗原结合。目前我国较多医院的输血科和检验科采用抗人球蛋白检测卡进行交叉配血和抗体筛查试验，抗CD38干扰此类试验，表现为不规则抗体筛查试验全阳、交叉配血全部不合。

另一方面，刚使用抗CD38单抗时患者直接抗人球试验结果为阳性，但通常一周后，患者直接抗人球试验变为阴性。分析直接抗人球试验转阴的可能原因有以下几点：① 抗CD38单抗改变了患者红细胞CD38抗原的亲和力；② 抗CD38单抗减弱了CD38抗原的表达［12］；③ 抗CD38与红细胞结合后，能快速清除体内小红细胞碎片［13］。不规则抗体筛查试验全阳性，一方面导致配血困难，另一面可掩盖同种抗体的存在，盲目输血可能导致严重的溶血性输血反应，造成对患者生命健康的威胁。另外，患者直抗阳性、自身对照阴性，且有多次输血经历，又非常容易被误判为血浆中存在高频抗原抗体，输血科无法找到相容性血液而不敢向临床发血，导致延误患者输血治疗，同样危及患者生命安全。抗CD38单抗的影响周期非常久，可达半年以上［14］。

2020年多家期刊发表了抗CD38干扰配血相关论文，可见抗CD38单抗给临床输血带来了很大的困扰。人CD38抗原属于Ⅱ类跨膜糖蛋白，细胞膜外的二硫键是维持其空间结构的主要化学键。 0.200 mol/L浓度的DTT能裂解CD38分子位于细胞外的二硫键，破坏了CD38分子的结构，使之失去与抗CD38结合的槽位。这种作用同样发生在细胞外存在二硫键的其他抗原分子，如Kell、Cartwright、 LW、Dombrock和Knops血型系统抗原。0.002 mol/L的DTT可以使Jsa和Jsb抗原变性，而不破坏其他抗原系统内抗原分子的结构，从而保留其与相应抗体结合的功能［5］。

本研究通过对0.200 mol/L DTT多次稀释至浓度为0.005 mol/L，处理不规则抗体筛选细胞4批次，处理献血员红细胞20人份，均获得阴性结果。可见该浓度的DTT即可破坏CD38抗原［15］，无需使用0.200 mol/L DTT处理红细胞，最大限度保留其他抗原系统中抗原的完整性，极大程度上保证了不规则抗体的检出，防止抗体的漏检，保障交叉配血的安全性和有效性。CD38单克隆抗体对输血相容性检测的干扰及其应对方案的专家共识中提到多种排除抗CD38干扰的方法［3］，笔者也尝试用酶处理红细胞，但结果并不理想。凝聚胺携带正电荷，可与CD38分子中的羧基结合，从而阻止抗CD38与之结合，从而排除干扰［3］。但笔者认为凝聚胺对弱抗体易漏检，敏感度不如抗人球蛋白检测卡方法。

对于存在抗CD38干扰的患者，先用低浓度DTT处理不规则抗体筛选细胞，确认抗体筛查阴性后再常规使用凝聚胺交叉配血，才能保障交叉配血的安全性。由于本研究案例较少，仅有2例，且距离抗CD38治疗最短时间都超过1个月，0.005 mol/L DTT对于刚治疗患者的消除干扰作用未能验证，因此笔者认为，在患者进行治疗之前进行不规则抗体筛查以及抗体鉴定实验，是对此类患者安全输血提供保障的有效措施。

利益冲突作者声明不存在利益冲突