化学发光法与酶联免疫吸附试验在乙型肝炎 病毒血清学检验中的应用

王娜娜 王婷婷

作者单位：264006 山东烟台，烟台业达医院检验科

乙型肝炎（乙肝）是一种由于感染乙型肝炎病毒引起肝脏病变的传染性疾病［1］，在临床上较为常见，以恶心、食欲减退、肝功能异常、肝区疼痛等为主要临床表现［2］。乙肝的潜伏期较长，且大部分患者在潜伏期内的临床症状并不明显，因此对乙肝的临床诊断有一定的难度，若患者未得到及时有效的治疗，会向肝硬化、肝功能衰竭进展，因此对疾病的早发现、早诊断、早治疗十分重要。患者在感染乙肝病毒后产生特异性抗体，故临床上一般通过乙肝病毒血清学检测进行诊断，其中实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）作为该疾病诊断的“金标准”，虽然具有较高的敏感度和检出率，但存在检测时间长、费用昂贵等不足［3］，因此需要寻找更加高效、准确的检测方法。酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）和化学发光法均为临床较为常用的检测方法，在实际应用中各有优势。本研究选择本院2020年1—12月 接收的110例疑似乙肝患者作为研究对象，就上述两种方法在乙肝病毒血清学检验中的效果进行对比分析，旨在为临床诊断乙肝提供更加可靠的数据支持，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选择2020年1—12月本院收治的110例疑似乙肝患者作为研究对象，其中男性63例，女性37例；年龄25～73岁，平均（49.65±4.49）岁。

1.1.1 纳入标准 ① 因出现发热、恶心、食欲不振、上腹部不适、肝区疼痛等症状而就诊被疑诊为乙肝者；② 认知功能正常，自愿参与本研究者。

1.1.2 排除标准 ① 存在原发性血液系统疾病者；② 存在相关代谢系统疾病、癌症者；③ 处于特殊时期（经期、妊娠期或哺乳期）的患者；④ 存在可能影响检验结果的疾病者；⑤ 存在精神障碍者。

1.1.3 伦理学 本研究符合医学伦理学标准，并经本院医学伦理委员会审批（审批号：20210702），所有检测均获得患者或家属的知情同意。

1.2 研究方法 在检验前1 d嘱所有受检对象从晚上至次日清晨维持空腹状态至少8 h，采集受检对象的空腹肘静脉血5 mL，放置在真空分离胶试管中。以3000 r/min进行离心处理，时间为10 min，将分离出的上层血清保存在-20 ℃冰箱中。

1.2.1 化学发光法 采用Sysmex HISCL-5000全自动化学发光分析仪（日本希森美康株式会社）及原装试剂乙肝病毒定量试剂盒，对血清标本进行检测，严格按照相关说明书进行操作。

1.2.2 ELISA 采用烟台艾德康生物科技有限公司生产的ELISA 400全自动酶联免疫分析仪以及北京万泰生物药业股份有限公司提供的ELISA测定试剂盒进行ELISA检测。试剂盒在室温条件下放置30 min，设置阳性、阴性及空白对照孔，于阳性、阴性对照孔中分别加入标准液50 μL，再加入50 μL特异酶，完成封膜处理后，使用振荡器将液体混合均匀。 于37 ℃水浴箱中放置样本，孵育30 min后清洗反应板，在显色后加入终止液。采用ELISA 400全自动酶联免疫分析仪对血清中的乙肝核心抗体（hepatitis B core antibody，HBcAb）、乙肝e抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）、乙肝e抗体（hepatitis B e antibody，HBeAb）、乙肝表面抗体（hepatitis B surface antibody，HBsAb）、乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）进行比色，记录检测结果。

1.3 观察指标及判定标准 ① 观察两种方法在不同血清HBsAg浓度下的敏感度。② 观察两种方法的乙肝病毒阳性检出率。HBcAb、HBeAg的正常参考值均为检测标本的吸光度值/临界值（样本A值/ cut off值，S/CO）＜1；HBeAb为S/CO＞1；HBsAb正常参考值为0～10 U/L；HBsAg正常参考值为0～ 50 U/L。判定标准为测量值不在参考值范围内则判定为阳性，反之则为阴性。③ 比较两种方法的乙肝病毒血清学检验结果。④ 从110例患者的血清中选取35份高、中、低浓度HBsAg阳性血清进行重复性试验，1日1次，计算批内、批间重复性。

1.4 统计学处理 采用SPSS 21.0统计软件处理数据。计数资料以例（%）表示，采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种方法检测不同血清HBsAg浓度的敏感度比较 不同血清HBsAg浓度下的ELISA检测敏感度均明显低于化学发光法（均P＜0.05）。见表1。

表1 化学发光法和ELISA对不同血清HBsAg浓度的检测敏感度比较

2.2 两种方法检测乙肝病毒的阳性检出率比较 110例受检的疑似乙肝患者中，化学发光法的乙肝病毒检出率明显高于ELISA〔86.36%（95/110）比 63.64%（70/110）〕，差异有统计学意义（χ2＝15.152， P＜0.001）。

2.3 两种方法检测乙肝病毒的结果比较 化学发光法对HBsAg、HBsAb、HBcAb、HBeAg、HBeAb的检验结果均明显高于ELISA（均P＜0.05）。见表2。

表2 化学发光法和ELISA对乙肝病毒的血清检验阳性检出率比较

2.4 两种方法的批内与批间重复性比较 两种方法批间不同浓度HBsAg重复性均高于批内检测结果；ELISA批内不同浓度HBsAg均高于化学发光法，批间低浓度、中浓度比化学发光法高，即ELISA重复性高于化学发光法。见表3。

表3 化学发光法和ELISA对不同血清HBsAg浓度的检测重复性比较

3 讨论

乙肝是一种发生率较高且传染性较强的疾 病［4］，乙肝病毒具有一定的耐高温性，容易经母乳喂养、输血、生活接触等多种途径传播。近年来，随着我国乙肝防控工作的深入开展，该疾病的发生率有所下降，但仍具有较大的发病基数，因此还需进一步加强防控工作。同时乙肝病毒筛查也是婚前和孕前检查的常规项目之一，当受检者HBsAg呈阳性时，会增加其配偶及子女的乙肝病毒感染风险，并可能对母婴结局产生不利影响，故加强婚前和孕前检查对于控制乙肝病毒的传播具有重要作用。乙肝长期迁延不愈会导致肝硬化和肝癌等并发症的发生［5］，进而威胁患者的生命安全，且由于目前临床上尚无治疗该疾病的特效药物或方法，即使在患者得到有效治疗后仍会携带乙肝病毒，因此定期筛查、保持随访意义重大。

乙肝的早期症状不典型，仅凭临床症状进行诊断易出现漏诊、误诊。选择何种诊断措施，科学有效地提高乙肝病毒阳性检出率是临床乙肝研究中的重点课题，且早期筛查能避免进一步引起并发症和其他器官损伤。在感染乙肝病毒后，能够在大部分受检对象的血清中检测到HBcAb，其是乙肝血清学标志物中敏感度较高的一种［6］。HBcAb在血清中存在时间长，可用于判断早期急性乙肝病毒感染。HBeAb的出现提示机体中的乙肝病毒复制数量逐渐减少或停止；而在HBeAb呈阳性的患者中，乙肝病毒DNA检测结果为阳性，提示机体内的病毒正处于大量复制阶段，故需要及时给予抗病毒治疗，反之则提示传染性较弱。同时部分患者的HBcAb滴度高，且在HBsAg为阴性时，受检者的血清中能够检测到HBcAb，故HBcAb滴度高对于判断机体是否感染乙肝病毒具有一定作用。HBeAg主要反映乙肝病毒的复制情况，当HBeAg超过正常参考值范围，则说明病毒复制数量多且具有较强的传染性［7］。HBeAg一般在机体感染乙肝病毒后2～6个月内可以在患者血清中检出。HBsAb属于保护性抗体，是机体为HBsAg产生的免疫反应性抗体，可在机体感染乙肝病毒后6～23周内被检测出，并在患者体内长期存在，当HBsAb呈阳性时，提示机体已获得免疫。HBsAg可在乙肝患者的血液、分泌物中检出，早期急性乙肝病毒感染患者中会从HBsAg阳性向阴性转变，在慢性乙肝患者中则HBsAg一直为阳性。

乙肝五项指标是乙肝诊断的敏感性标志物，目前多采用化学发光法、ELISA进行检测，均具有操作简单、价格低廉的优点［8］。ELISA是指将使抗原或抗体结合到某种固相载体表面产生固相抗原或与某种酶连接成酶标抗原或抗体，并保持其免疫活性，能将未结合的抗原清除，根据显色不同对抗原和抗体的阳性情况进行判定。ELISA适用于大批量样本的检测，但在临床实际工作中容易出现样本污染的情况，导致假阳性或假阴性结果的出现，造成临床实际检验需求无法得到满足［9-10］。

化学发光法属于分子发光光谱分析法，是利用仪器对体系化学发光强度的检测，而确定待测物含量的一种痕量分析方法，与其他发光分析法的本质区别在于体系产生发光（光辐射）所吸收的能量来源不同。化学发光法利用自动化仪器进行检测，具有较高的自动化和标准化水平，检测结果不易受到外界因素的干扰，可减少人工操作产生的误差，并且可使电磁消失速度加快，促进复合、游离抗体的分离，在乙肝病毒标志物定量检测中的敏感度高，并可动态监测乙肝病毒感染［11-12］。同时化学发光法所用试剂消耗量低、稳定性高、易储存，适合在临床 中推广。本研究结果显示，与ELISA比较，化学发光法对不同血清HBsAg浓度下的检测敏感度、阳性检出率以及血清乙肝五项指标的检出率均更高，充分说明了化学发光法具有较高的敏感度和特异度。分析原因在于，ELISA无法对疑似乙肝病毒感染者的复制情况和感染程度进行判断。在无偿献血者等乙肝病毒感染率较低的人群中更容易出现假阳性结果［13］。 另外，国内不同厂家生产乙肝ELISA试剂盒的截止计算方法、检测一致性均存在较大差异，会导致假阳性结果。在临床实验室检测中，需要先对试剂盒是否完全符合要求进行评估，完全符合的试剂盒才可使用，以降低假阳性率。化学发光法借助全自动仪器和配套试剂，可减少人为因素对检测结果造成的影响［14］，实现了检测的标准化、自动化、科学化，从而可提升检测的准确度，获得更加稳定的检测结果，直接确定抗体、抗原的含量或浓度，减少误诊、漏诊情况的发生［15-16］。同时化学发光法具有诊断范围广、时间短、分析方法简单等优势，虽然可能会出现漏诊，但乙肝病毒的检出率仍较高［17］。刘静等［18］研究表明，化学发光法的HBcAb、HBeAg、HBeAb、HBsAb、HBsAg阳性检出率均高于ELISA，提示化学发光法更具推广应用价值，所得结果和结论与本研究相似，佐证了此次研究结果具有较高的真实性和可靠性。与同类型研究进行比较，本研究还进一步探究了不同血清HBsAg浓度下的检测敏感度，结果显示化学发光法对乙肝病毒检测的敏感度较高。本研究不足之处在于，未进一步对对检测数据的准确度、敏感度等进行评估，应在今后加强此方面的研究。 综上所述，化学发光法应用于乙肝病毒血清学检验中的临床价值高于ELISA，适合在临床中进一步推广使用。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突