氨肽酶P2在上皮性卵巢癌组织中的表达及临床意义

苏引利，李琳琳，莫佳娅，段浩然，张嘉琳，王秋杰，秦利影，吴 晗，谢 娅

(1.郑州大学第一附属医院妇产科,河南 郑州 450052；2.郑州大学第一附属医院肿瘤科，河南 郑州 450052；3.郑州大学医学科学院,河南 郑州 450052)

卵巢癌是常见的女性恶性生殖系统肿瘤，其死亡率位于妇科恶性肿瘤之首[1]，全球年龄标准化的5 a净生存率大多在30%～50%之间[2]。目前卵巢癌的主要治疗方法为手术和化疗，由于其早期临床症状无特异性，80%的患者就诊时已达中晚期，但即便是中晚期患者，有效的肿瘤减灭术仍可延长患者的生存时间[3-4]，而首次手术后癌残存灶大小是影响预后的关键因素之一。因此，无论是早诊断还是手术完全切除原发癌灶和转移灶对中晚期卵巢癌患者的治疗都有着重要的作用。

氨基肽酶P2(XPNPEP2)编码673个氨基酸的膜结合蛋白，定位于染色体Xq25-26.1上，是以Xaa-Pro作为识别位点广泛存在于生物体的一种N-末端亚胺键的水解酶[5]。体内存在广泛含有Xaa-Pro位点的活性肽为其底物，如激素、生长因子、神经递质等[6]。但既往对于XPNPEP2的研究多集中于XPNPEP2参与缓激肽代谢[7]，与血管紧张素转换酶抑制剂诱导的血管性水肿有关，继而引发咳嗽[8]、低血压[9]等症状。近年来，XPNPEP2在肿瘤中的调控作用受到重视。XPNPEP2在宫颈癌、胃癌、结直肠癌和乳腺癌组织中表达较正常组织上调，并且在结直肠癌和乳腺癌与疾病进展和患者的不良预后有关[10-14]。Cheng等[14]的研究表明，XPNPEP2通过诱导上皮-间充质转变促进宫颈癌发展。最近，有文献报道XPNPEP2是组织金属蛋白酶抑制剂1(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1,TMTP1)的靶蛋白之一[15]，TMTP1是一种新型肿瘤归巢肽[16-17]，能识别并结合原位肿瘤和血管源性或转移性肿瘤组织表面的特异性受体[18]，被用作抗肿瘤药物的输送载体，如联合抗菌肽D2[19]、白喉毒素[20]、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体[21]以及顺铂和紫杉醇前体药物[22]等。TMTP1不仅准确靶向肿瘤组织提高抗肿瘤疗效，还能减轻脱靶导致的药物毒性。但是，XPNPEP2/TMTP1能否作为用药载体靶向识别卵巢癌原发灶和转移灶尚无明确定论。

目前，上皮性卵巢癌作为一种高度侵袭性肿瘤，XPNPEP2在其中的表达情况尚未有详细报道。本文中我们运用免疫组化和蛋白印迹的方法检测XPNPEP2蛋白在正常卵巢组织、上皮性卵巢癌原发灶及与之配对的转移癌灶和癌旁组织中的表达情况，并分析其与上皮性卵巢癌临床病理特征及预后的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2019年1月至2021年9月于郑州大学第一附属医院确诊为上皮性卵巢癌并经过手术治疗的患者40例，所取肿瘤原发灶标本均经病理确诊为上皮性卵巢癌，其临床分期采用国际妇产科联盟(FIGO)制定的卵巢癌手术-病理分期(FIGO，2014年)标准。并同时取患者转移至大网膜的转移癌灶和癌旁组织35例。收集非癌患者经手术所取的正常卵巢组织标本15例作为对照。本次标本使用已经伦理委员会批准。本组病例收集情况见表1。

表1 XPNPEP2表达与上皮性卵巢癌患者临床病理特征之间的关系 n(%)

1.2 主要试剂免疫组化一抗XPNPEP2(25945-1-AP)、二抗HRP标记的山羊抗兔(GB23303)、DAB显色试剂盒(G1211)、苏木素染色剂购自武汉赛维尔生物科技有限公司。

1.3 蛋白印迹将绿豆粒大小组织放入1.5 mL离心管中，加适量组织裂解液(每mL RIPA裂解液内含100 mmol/L的苯甲基磺酰氟10 μL)并放入2～3颗研磨珠；震荡研磨仪研磨；超声裂解组织细胞；4 ℃、12 000 r/min离心15 min取上清；用二喹啉甲酸蛋白定量试剂盒配平各样品蛋白浓度后，加入1/4体积蛋白上样缓冲液；100 ℃金属浴10 min变性；质量分数10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶80 V电泳90 min分离蛋白，300 mA电流2 h将蛋白全部转移至聚偏氟乙烯膜；质量分数5%脱脂牛奶封闭2 h；兔抗人XPNPEP2多克隆抗体(11 000)一抗4 ℃孵育过夜；二抗(14 000)室温孵育2 h；漂洗后ECL发光试剂盒显色。使用Image J软件测定蛋白相对表达量。以β-actin(14 000)作为蛋白表达的内参。

1.4 免疫组化将直径1 cm左右的标本组织浸泡于组织固定液中，将组织经过脱水、渗透及石蜡包埋，将蜡块以4 μm做连续切片，筛选出完整的样本切片首先做HE染色，以确定所取组织为目标组织。然后将与之对应的样本切片进行免疫组化染色。首先将切片置于恒温箱中烘烤脱蜡；再经过二甲苯、梯度酒精脱蜡脱水；组织切片依次进行抗原修复、阻断内源性过氧化物酶、血清封闭、XPNPEP2一抗孵育过夜、HRP标记二抗孵育50 min、DAB显色、苏木精复染细胞核、自来水分化、最后脱水及中性树脂封片。切片于正置显微镜观察、图像采集分析。

1.5 结果判断免疫组化结果由2名有经验的实验员进行双盲法阅片，并进行评分。切片中符合病理类型的细胞中出现棕色或褐色为XPNPEP2结果阳性细胞，按照组织染色强度和阳性细胞面积进行综合评分。先将染色深浅与背景着色对比，再进行染色强度打分：无色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。阳性细胞所占的百分比打分：阴性为0分，阳性细胞≤10%为1分，>10%～50%为2分，>50%～75%为3分，>75%为4分。评分标准为两项评分相乘，得分为0～3分评估为XPNPEP2低表达，4～12分评估为XPNPEP2高表达。

1.6 数据库使用基因表达谱动态分析数据库(http://gepia.cancer-pku.cn/)绘制分析XPNPEP2高表达与低表达患者的疾病无进展生存期和总生存期的关系[23]。

2 结果

2.1 XPNPEP2在不同卵巢组织中的表达XPNPEP2主要定位在上皮性卵巢癌原发灶与转移癌灶肿瘤细胞的细胞膜和细胞质中，表现为细胞内出现棕褐色颗粒。XPNPEP2蛋白在上皮性卵巢癌原发灶和转移癌灶呈高表达(4～12分)。而在正常卵巢组织及癌旁组织呈低表达(0～3分)，表现为正常细胞质内及细胞膜无染色或部分细胞略呈淡黄色。

2.1.1 XPNPEP2在正常卵巢组织和上皮性卵巢癌原发灶中的表达 免疫组化染色结果显示，XPNPEP2在正常卵巢组织中多为低表达，高表达率13.33%(2/15)，而在上皮性卵巢癌原发灶中多为高表达，高表达率为82.50%(33/40)(χ2=22.553，P<0.001)。蛋白印迹结果显示，上皮性卵巢癌原发灶中XPNPEP2蛋白相对表达量为0.893±0.214，明显高于正常卵巢组织的0.269±0.155(t=4.843,P= 0.001)。见图1、2。

图1 免疫组化染色检测XPNPEP2在正常卵巢组织和上皮性卵巢癌原发灶组织中的表达

图2 蛋白印迹检测XPNPEP2在正常卵巢组织和上皮性卵巢癌原发灶组织中的表达

2.1.2 XPNPEP2在癌旁和转移癌灶组织中的表达 免疫组化染色结果显示，XPNPEP2在癌旁组织中多为低表达，高表达率为14.29%(5/35)，而在转移癌灶组织中多为高表达，高表达率为91.43%(32/35)(χ2=41.794，P<0.001)。蛋白印迹结果显示，转移癌灶组织中XPNPEP2蛋白的相对表达量为1.032±0.202，明显高于癌旁组织的0.276±0.176(t=6.237，P<0.001)。见图3、4。

图3 免疫组化染色检测XPNPEP2在癌旁组织和转移癌灶组织中的表达

2.1.3 XPNPEP2在上皮性卵巢癌原发灶和转移癌灶组织中的表达 免疫组化染色结果显示，XPNPEP2在上皮性卵巢癌原发灶[82.50%(33/40)]和转移癌灶[91.43%(32/35)]中均多为高表达，比较差异无统计学意义(χ2=0.631，P=0.427)。蛋白印迹结果显示，上皮性卵巢癌原发灶与转移癌灶中XPNPEP2蛋白的表达比较差异无统计学意义(t=0.624，P=0.549)。见图5、6。

图4 蛋白印迹检测XPNPEP2在癌旁组织和转移癌灶组织中的表达

图5 XPNPEP2在上皮性卵巢癌原发灶和转移癌灶组织中的表达

2.2 卵巢癌患者XPNPEP2蛋白的表达与临床病理特征之间的关系上皮性卵巢癌患者XPNPEP2表达水平与患者年龄、病理类型、分化程度、肿瘤大小、腹水以及FIGO分期均无相关性(χ2=0.519，P=0.471；P=0.204；χ2=0.275，P=0.600；χ2=0.132，P=0.716；χ2=0.519，P=0.471；χ2=3.680，P=0.055)。见表2。

2.3 XPNPEP2蛋白表达与卵巢癌患者预后的关系为了解XPNPEP2在卵巢癌中高表达是否与患者的预后有关系，我们从GEPIA在线分析数据库提取398例卵巢癌患者信息发现，XPNPEP2高表达组与低表达组的疾病无进展生存、总生存比较差异均无统计学意义(P=0.900、0.099)。见图7。

图6 蛋白印迹检测XPNPEP2在上皮性卵巢癌原发灶和转移癌灶组织中的表达

图7 不同XPNPEP2表达卵巢癌患者疾病无进展生存曲线(左)与总生存曲线(右)比较

3 讨论

上皮性卵巢癌是最常见的卵巢癌类型，常见于50岁以上患者。目前，上皮性卵巢癌治疗重难点在于早诊断、早治疗，亟需发现新的治疗方法、改善药物输送等来提高患者的生存率并改善其预后[24]。

XPNPEP2主要在肾脏、前列腺、结肠、肝脏及胰腺组织中表达，在卵巢组织中几乎不表达。也有证据表明其在宫颈癌、胃癌、前列腺癌、结直肠癌和乳腺癌中表达高于正常组织，但在卵巢癌中表达情况尚不明确。罗丹枫[15]等通过检测5例卵巢癌原发灶、正常卵巢组织和2例远处转移癌灶标本中XPNPEP2的RNA发现，XPNPEP2在原发灶中的表达要远高于正常组织，且在2例转移灶中XPNPEP2的表达和正常组织差别不显著，但由于标本量过少限制其可靠性。本研究通过收集40例上皮性卵巢癌原发灶和配对的35例转移灶、癌旁组织及15例正常卵巢组织发现，XPNPEP2在上皮性卵巢癌原发灶中的表达显著高于正常卵巢组织，在转移灶中的表达显著高于癌旁组织，而在上皮性卵巢癌原发灶与转移癌灶中表达无明显差异。

为进一步探讨XPNPEP2高表达在卵巢癌发生、发展中的作用，我们分析XPNPEP2与上皮性卵巢癌患者的临床病理特征相关性发现，XPNPEP2在卵巢癌组织中的表达高低与患者年龄、病理类型、分化程度、肿瘤大小、有无腹水以及FIGO分期均无关。通过GEPIA数据库对398例卵巢癌患者进行生存分析发现，尽管卵巢癌患者XPNPEP2低表达组与高表达组的生存率无统计学差异，但XPNPEP2低表达组5 a生存曲线始终在高表达组之上，提示其可能与不良预后相关。本研究所收集标本主要为Ⅲ～Ⅳ期，Ⅰ～Ⅱ期上皮性卵巢癌数据较少，后续需扩大样本量分析XPNPEP2对卵巢癌患者预后的影响。

2009年XPNPEP2被证实为肿瘤归巢肽TMTP1的受体[15]。Yang等[16]经过体外体内实验发现TMTP1可特异性结合到一系列中高度转移潜能肿瘤细胞，但不与低度转移潜能或非转移性细胞结合。静脉注射结合荧光素的TMTP1经24 h即可强烈并特异性靶向小鼠的转移灶，甚至是隐匿性转移灶。与之一致，虽然XPNPEP2在前列腺癌组织中的表达低于正常前列腺组织，但在有局部侵袭和淋巴结转移的前列腺癌组织中表达高于局限性前列腺癌组织[25]。但我们的结果显示XPNPEP2在卵巢癌原发灶和与转移癌灶中表达无明显差异，提示XPNPEP2在不同类型肿瘤原发癌灶的表达有差异。因此，TMTP1、XPNPEP2不仅可以作为临床工作中区分原发性恶性肿瘤和转移性肿瘤的标志物，也可利用荧光显影术标记XPNPEP2实时准确定位转移灶进行手术切除。此外，作为广泛用于抗肿瘤药物的输送载体，TMTP1可能通过特异性识别转移性肿瘤组织表面的XPNPEP2受体，用于准确定位肿瘤转移灶进行肿瘤的靶向治疗。本研究发现XPNPEP2在上皮性卵巢癌及其转移癌灶中均高表达，为后期开发XPNPEP2、TMTP1示踪剂进行手术准确定位上皮性卵巢癌原发灶及转移灶、优化药物载体进行肿瘤精准治疗提供理论依据。