肉桂提取物对阿尔茨海默病大鼠学习记忆和氧化应激水平的影响及机制

李冉 田子明

(焦作职工医学院 1基础教研室，河南 焦作 454000；2临床部)

阿尔茨海默病(AD)又称原发性老年痴呆，是一种在老年人中最常见的不可逆的神经退行性疾病，会损伤患者认知、行为和学习能力。该神经退行性疾病的病理特征为β-淀粉样蛋白(Aβ)和过度磷酸化的tau聚集体，分别形成淀粉样斑块和神经原纤维缠结,从而引起神经元功能障碍和突触可塑性受损。研究发现氧化应激和炎症反应与Aβ有关〔1〕。肉桂为我国药食同源的传统药物及香料，具有补火助阳、温煦气血、散寒止痛、温通经脉等功效。现代药理研究表明，肉桂含有挥发油、黄酮类、萜类等多种化学成分，具有扩张血管、抗胃溃疡、抑菌、抗氧化等作用〔2〕。本文拟分析不同剂量肉桂提取物对AD模型大鼠学习记忆能力和氧化应激水平的作用。

1 材料与方法

1.1动物与分组 SPF级SD雄性大鼠，购于河南省实验动物中心，许可证号：SCXK(豫)2017-0001。随机数字表法将大鼠分为对照组，模型组，低、中、高剂量组和阳性药物对照组，每组9只。

1.2主要药品和试剂 肉桂购于亳州中药材市场；吡拉西坦购于东北制药集团沈阳第一制药有限公司，国药准字H21021775，规格：0.4 g×100片×1瓶/盒；Hoechst 33342溶液购于上海信裕生物科技有限公司；大鼠晚期糖基化终末产物(AGEs )酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒、大鼠丙二醛(MDA) ELISA试剂盒均购于上海瓦兰生物科技有限公司；大鼠过氧化氢酶(CAT)ELISA试剂盒购于武汉菲恩生物科技有限公司；大鼠超氧化物歧化酶(SOD)ELISA试剂盒购于武汉益普生物科技有限公司；SOD1、SOD2、络氨酸激酶受体(Trk)B、β-actin抗体均购于美国Cell Signaling Technology公司；脑源性神经营养因子(BDNF)、p-TrkB、NeuN、山羊抗兔IgG辣根过氧化物酶(HRP) 购于英国Abcam公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司；电化学发光(ECL)检测试剂盒购于爱必信(上海)生物科技有限公司。

1.3主要仪器 Varioskan LUX 多功能酶标仪〔赛默飞世尔科技(中国)有限公司〕；DMI6000B荧光显微镜(德国莱卡公司)；Gel Doc XR+全自动凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)；XR-XM101大小鼠Morris水迷宫(上海欣软信息科技有限公司)。

1.4模型构建和分组 参照参考文献〔3〕的方法构建AD大鼠模型。使用二甲基亚砜(DMSO)溶解Aβ25～35，置于37℃培养箱中老化处理7 d。使用10%水合氯醛麻醉大鼠，切开头部皮肤，在海马区位置缓慢注射Aβ25～35，术后缝合，在伤口处滴加青霉素防止伤口感染。对照组注射等量生理盐水。

造模成功次日，低、中、高剂量组每日灌胃给药终浓度分别为200、400和600 mg/kg肉桂提取物〔4〕。阳性药物对照组采用0.5 g/kg吡拉西坦灌胃。对照组和模型组每日灌胃等量生理盐水，连续灌胃60 d。

1.5Morris水迷宫实验检测各组学习记忆能力〔5,6〕在所有象限内提供均匀照明，并为大鼠提供固定的视觉线索。在水迷宫中注入清水，没过平台1 cm，加入适量二氧化钛粉使水不透明。保持水池温度在(22±2)℃。每只大鼠训练2次/d，在连续训练4 d后开始隐匿平台获得实验，即将大鼠面向池壁从东、南、西、北4个象限中的任一方位入水点放入水池，记录大鼠从入水至找到平台的时间即为逃避潜伏期。未能在60 s内找到平台的大鼠，将其引导至平台并停留15 s，将其逃避潜伏时间记为60 s。每次更换入水象限进行测试，共测试4 d。在隐匿平台获得实验结束后将平台撤出，将大鼠放入水中90 s，测定大鼠游泳距离和进入平台次数，确定到达准确平台位置的延迟时间。每次训练完成后将小鼠立即取出并擦干保温以避免应激反应。

1.6ELISA试剂盒检测AD大鼠氧化应激的影响 在行为学检测后，处死大鼠，收集各组海马组织，将海马组织充分研磨匀浆，离心取上清，分别按照AGEs、MDA、CAT和SOD ELISA试剂盒说明书操作，检测海马组织中氧化应激相关指标。

1.7Western印迹检测各组海马组织中SOD1和SOD2表达情况〔7〕取大鼠海马组织，液氮研磨，加入RIPA裂解液提取总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度。使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离总蛋白，每孔蛋白质上样量固定为30 μg。将分离的蛋白条带转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂奶粉封闭。TBST洗膜后，将PVDF膜放入一抗稀释液〔SOD1(1∶1 000)、SOD2(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)〕中，4℃孵育过夜。弃去一抗稀释液，TBST洗膜3次，每次10 min，加入二抗(1∶2 000)，室温孵育1 h。使用ECL试剂盒显影，全自动凝胶成像仪拍照，以β-actin为内参，计算SOD1蛋白和SOD2蛋白的相对表达量。

1.8免疫荧光检测海马组织中NeuN表达情况〔8〕将各组海马组织使用4%多聚甲醛溶液固定，进行常规组织学操作，石蜡包埋切片，将切片贴在载玻片上，加入封闭溶液室温封闭1 h。然后，将切片放置在一抗溶液(NeuN 1∶500)中，4℃孵育过夜，冲洗切片，加入二抗溶液室温浸泡2 h。然后用Hoechst 33342溶液染色切片。冲洗盖玻片3次，用甘油胶覆盖，并在荧光显微镜下拍照观察。

1.9Western印迹检测各组BDNF/TrkB通路相关蛋白表达情况〔9〕取各组海马组织进行Western印迹分析。使用SDS-PAGE分离蛋白，PVDF转膜，封闭，加入一抗溶液(稀释比例均为1∶1 000)，在4℃孵育过夜。洗膜后加入二抗溶液室温下孵育2 h。显影，拍照，计算蛋白表达水平。

1.10统计学方法 使用SPSS26.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1肉桂提取物对AD大鼠学习记忆功能的影响 模型组与对照组相比，游泳距离明显增加，进入平台次数明显减少，延迟到平台时间明显增长，逃避潜伏期时间明显增长(P<0.05)。与模型组比较，不同剂量组和阳性药物对照组逃避潜伏期、游泳距离及延迟到平台时间明显缩短，进入平台次数明显增加(P<0.05)。见表1。

2.2肉桂提取物对AD大鼠氧化应激的影响 与对照组相比，模型组大鼠海马组织中AGEs和MDA水平明显升高，CAT和SOD水平明显降低(P<0.05)。与模型组相比，低、中、高剂量组及阳性药物对照组AGEs和MDA水平明显降低，CAT和SOD水平明显升高(P<0.05)。见表2。

2.3肉桂提取物对AD大鼠海马组织SOD表达的影响 模型组海马组织中SOD1和SOD2蛋白表达水平较对照组明显降低(P<0.05)。与模型组相比，低、中、高剂量组及阳性药物对照组明显升高(P<0.05)。见图1，表3。

表3 各组海马组织中SOD1和SOD2蛋白表达水平比较

2.4肉桂提取物对AD大鼠海马组织NeuN表达的影响 模型组NeuN表达水平〔(21.58±2.31)%〕较对照组〔(64.71±4.76)%〕明显降低(P<0.05)。与模型组相比，肉桂提取物不同剂量组〔低、中、高剂量组(34.78±1.66)%、(38.82±2.19)%、(44.88±1.93)%〕和阳性药物对照组〔(37.27±2.81)%〕均可明显增加海马组织中NeuN的表达。见图2。

图2 各组海马组织中NeuN表达(免疫荧光，×100)

2.5肉桂提取物对AD大鼠海马组织中BDNF/TrkB通路的影响 各组海马组织中TrkB蛋白水平无明显差异(P>0.05)。模型组海马组织中BDNF和p-TrkB蛋白水平较对照组明显降低(P<0.05)。与模型组相比，低、中、高剂量组和阳性药物对照组BDNF和p-TrkB蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。见图3，表4。

图3 各组海马组织中BDNF/TrkB通路相关蛋白表达水平比较

表4 各组海马组织中BDNF/TrkB通路相关蛋白表达水平比较

3 讨 论

AD是一种严重的神经退行性疾病，影响着全球大多数老年人。血脑屏障(BBB)是维持大脑结构和功能稳态微环境的必要条件〔10〕。研究发现，在AD病理过程中，氧化应激反应导致的小胶质细胞活化是活性氧簇(ROS)的主要慢性来源之一，从而导致神经毒性和BBB功能损害。Burak等〔11〕研究发现，肉桂可能是一种有前途的以炎症和氧化应激增加为特征的治疗神经退行性疾病的药物，能够在AD实验模型中表现出显著的促认知作用，包括氧化应激减少和显著抑制β-分泌酶活性〔11〕。NeuN是一种位于神经元核内的特异性核蛋白，是在神经退行性疾病的研究中常用的量化正常神经元和识别神经元缺失的标志物，退化的神经元往往会失去这一标志物〔12〕。本实验结果与前人的研究结果一致。

氧化应激是机体内ROS等自由基显著增加，超过机体本身的清除能力，造成氧化系统和抗氧化系统失衡，最终造成细胞损伤或凋亡〔13〕。SOD1 是一种主要的抗氧化剂酶。SOD2是一种线粒体解毒酶，能催化超氧化物转化为过氧化氢，可以保护细胞免受ROS的损害。SOD和CAT可以消除超氧化物和过氧化氢，MDA 可以反映氧化应激损伤的程度，其水平升高可以直接反映其遭受了过度的氧化应激损伤〔14〕。肉桂提取物可以明显降低AD大鼠海马组织中AGEs和MDA的产生和积累，增加CAT和SOD的活性；且随着肉桂提取物所用剂量的提高，海马组织中SOD1和SOD2蛋白表达水平也逐渐升高。王燕军〔15〕研究发现，氧化应激与 BDNF 信号通路相互影响在糖尿病认知功能的病理发展中发挥重要作用。

有研究发现，BDNF/TrkB通路的激活，有助于改善AD大鼠的学习记忆能力〔16〕。BDNF是神经营养因子家族成员之一，在成熟后与激活TrkB结合并激活TrkB，参与神经细胞功能的调控，在AD的发病和发展中发挥重要作用〔17〕。本实验中，肉桂提取物可以明显升高BDNF和p-TrkB的表达水平，激活BDNF/TrkB通路，从而对AD模型大鼠的学习记忆能力起到改善作用。

综上，肉桂提取物对AD模型大鼠的学习记忆能力具有一定改善作用，增强氧化应激能力，其作用机制主要与BDNF/TrkB通路的激活有关。