SMAD2 和SMAD3 在人胚胎干细胞分化过程中的不同调控作用

赵冰楠，马双羽，胥春龙，王 琼

1.上海交通大学医学院组织胚胎学与遗传发育学系，上海市生殖医学重点实验室，上海市“细胞稳态调控与疾病”前沿科学研究基地，上海 200025；2.上海脑科学与类脑研究中心，上海 200031

转化生长因子β（transforming growth factor β，TGFβ） 超家族的细胞因子，包括TGFβ、活化素（activin）、 nodal 生 长 分 化 因 子（nodal growth differentiation factor，Nodal） 和 骨 形 态 发 生 蛋 白（bone morphogenetic protein，BMP）等，参与调控后生动物发育、组织稳态与再生、免疫监测以及肿瘤发生等过程。TGFβ 信号异常会导致发育缺陷、免疫紊乱、纤维化形成和癌症等疾病的发生［1］。TGFβ 超家族细胞因子与TGFβ Ⅱ型受体结合后，TGFβ Ⅱ型受体将磷酸化TGFβ Ⅰ型受体，活化的Ⅰ型受体进而招募SMAD 蛋白（drosophila mothers against decapentaplegic protein） ——SMAD2 和SMAD3，并磷酸化其C-末端Ser-Ser-X-Ser（SSXS）序列。磷酸化的SMAD2/3 与通用SMAD4 形成复合物后入核，进而与靶基因的启动子和/或增强子上的SMAD结合元件结合，从而调控基因转录［1］。

TGFβ 家族成员广泛存在于胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）中。ESC 是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞。人胚胎干细胞（human embryonic stem cell，hESC）存在着由TGFβ/activin 诱导磷酸化的SMAD2/3。通过SB431542 抑制TGFβ/activin受体活性，SMAD2/3的磷酸化水平下降将促进hESC 自发分化［2-3］。并且，SMAD2/3 还可以与多能性因子NANOG 同源盒（nanog homeobox，NANOG）的启动子结合，从而调控NANOG 的表达［4-5］。这些研究证实了TGFβ信号对于维持hESC多能性的重要作用。在合适的条件下，ESC可以在体外模拟胚胎早期的发育过程，包括分化成为3 个胚层：外胚层、中胚层和内胚层。在缺乏TGFβ 信号的情况下，人和小鼠的ESC 均默认分化成为外胚层，而中胚层和内胚层的分化则需要TGFβ 家族Nodal/activin和BMP 等信号的诱导激活［6］。例如，Nodal/activin活化的SMAD2/3 可直接与内胚层谱系特异性因子性别决定区Y 框蛋白17（sex determining region Y-box 17，SOX17）、叉头框转录因子A2 （forkhead box A2， FOXA2）、 GATA 结 合 蛋 白6 （gata binding protein 6， GATA6） 和GSC 同 源 盒（goosecoid homeobox，GSC）等结合，诱导hESC 向定型内胚层（definitive endoderm，DE）分化；SMAD2/3 还可进一步与脱中胚蛋白（eomesodermin，EOMES）相互作用，启动内胚层基因网络的转录［7-8］。因此，ESC向中内胚层（mesendoderm，ME）分化的过程中，TGFβ信号通路发挥着极其重要的作用。

SMAD 蛋白是经典的TGFβ 信号下游关键的转录因子。SMAD2 和SMAD3 的蛋白结构高度相似，但全长的SMAD2 的MH1 结构域中还存在一个由3号外显子（exon 3，E3）编码的30 个氨基酸区域。当这个外显子被剪接后，SMAD2 将产生在结构和功能上类似于 SMAD3 的短蛋白质产物（SMAD2β）［9］。由于SMAD2 和SMAD3 在结构上较为相似，因此两者常被视为同等功能的转录因子。但是，不少研究已经表明SMAD2 和SMAD3 的功能其实并不完全相同。Smad2与Smad3敲除小鼠的表型各异。Smad2-/-小鼠因为原肠胚发育障碍而死亡，而Smad3-/-小鼠的胚胎却基本正常［10-12］。在嵌合体实验中，SMAD2 缺陷的ESC 不能形成DE［13-14］。此外，SMAD2，而非SMAD3，在TGFβ 信号作用下可直接活化NANOG 的表达，因此对hESC 和小鼠上胚层干细胞的多能性维持更为重要［15］。没有TGFβ信号刺激时，SMAD2 和SMAD3 呈现不同的亚细胞定位——SMAD2 主要分布于细胞质，而SMAD3 则倾向于聚集在细胞核［9，16］。在小鼠多能性细胞中，先驱因子叉头框转录因子H1 （forkhead box H1，FOXH1）首先将SMAD3 募集到ME 分化基因的启动子上；而SMAD2 在细胞质内等待TGFβ 信号的来临。一旦TGFβ 诱导的分化启动，SMAD2 被磷酸化激活，并与SMAD4 结合。TGFβ 信号驱动的SMAD2-SMAD4 复合物将分化信号传递到细胞核内，并与FOXH1-SMAD3 共同结合迅速启动ME 相关基因的表达［9］。

虽然，TGFβ 家族在胚胎发育过程中具有非常重要的调控作用，但在hESC 中，其下游关键转录因子SMAD2 和SMAD3 对hESC 的调控机制尚不清楚。本研究将通过比较hESC 中SMAD2 和SMAD3 的表达，以及SMAD2或SMAD3敲除对hESC 多能性基因以及分化过程中神经外胚层（neuroectoderm，NE）和ME相关基因表达的影响，揭示SMAD2 和SMAD3 在调控干细胞功能方面的差异，进一步解析TGFβ-SMAD复杂的信号转导网络，以期揭示早期胚胎发育过程中信号调控机制，为探索疾病机制和治疗等方面的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 hESC（H1-icas9）由纪念斯隆-凯特琳癌症中心（Memorial Sloan-Kettering Cancer Center）的HUANGFU实验室建立［17］并赠予。

1.1.2 质粒 lentiGuide-Puro（#52963）、psPAX2（#12260） 和pMD2.G （#12259） 质 粒 均 购 自 美 国Addgene 公 司； pLVX-Tight-Puro 和pLVX-Tet-On Advanced（#632162）质粒均购自美国Clontech公司。

1.1.3 主要试剂 Essential 8 培养基、Essential 6 培养基、Advanced RPMI 培养基、GlutaMAX、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、乙二胺四乙酸（EDTA）、青霉素/链霉素、PowerUp™SYBR™Green 预混液和Pierce™Coomassie Plus（Bradford）检测试剂均购自美国Thermo Fisher Scientific 公司，ROCK 抑制剂Y-27632 2HCl（S1049，美国Selleck 公司），活化素A（activin A，AC）（12014E，美国PeproTech 公司），TGFβ 抑制剂SB431542（161410，美国Tocris 公司），糖原合成酶激酶-3 （glycogen synthase kinase 3，GSK-3） 抑 制 剂CHIR99021 （4423，美 国Tocris 公司），BMP 抑制剂LDN193189 （1509，美国Axon Medchem 公司），荧光二抗IRDye 800CW/680RD（美国LI-COR 公司），SMAD2/3 抗体（8685S）、SMAD2抗体（5339S）、SMAD3 抗体（9523S）、SOX1 抗体（4194）均购自美国Cell Signaling Technology 公司，八聚体结合转录因子4（octamer-binding transcription factor 4， OCT4） 抗 体 （5279）、 SOX2 抗 体（365823） 购自美国Santa Cruz 公司，SOX17 抗体（AF1924）、C-X-C 模 体 趋 化 因 子 受 体4 （C-X-C motif chemokine receptor 4，CXCR4）抗体（FAB170 A）购自美国R&D 公司，γ-微管蛋白（γ-tubulin）抗体（T6074，美国Sigma 公司），配对盒因子6（paired box 6， PAX6） 抗 体 （901301， 美 国BioLegend 公司），EOMES 抗体（11-4877-41，美国eBioscience公司）。

1.2 方法

1.2.1SMAD敲除细胞系构建 利用iCRISPR 方法［17］构 建 H1-icas9 的SMAD2敲 除 （SMAD2knockout， SMAD2KO） 和SMAD3敲 除（SMAD3knockout， SMAD3KO） 细 胞 系。 将SMAD2和SMAD3的 小 型 导 引RNA （small-guiding RNA，sgRNA）克隆入lentiGuide-Puro［18］质粒中，sgRNA的靶向序列分别为：SMAD2，ATGTTATATATTGCC GATTA；SMAD3， ACCTGAATGGGCCTTTGCAG。在HEK293T 细胞中使用Lipofectamine2000 （美国Thermo Fisher Scientific 公司）包装慢病毒，收集转染48 h 的慢病毒去感染H1-icas9 细胞。H1-icas9 细胞感染了包含sgRNA 的慢病毒后，通过每日持续添加强力霉素（doxycycline，dox）2 mg/mL 诱导Cas9 表达5 d。保持H1-icas9 细胞以单细胞密度生长，以允许克隆细胞系的扩增与分离。克隆的挑选、基因分型和扩增按照文献报道的方法进行［17］。

1.2.2 在SMAD敲除细胞系中过表达SMAD蛋白建立SMAD2和SMAD3的dox 诱导表达质粒系统。pLVX-Tight-Puro 是一种受四环素诱导的慢病毒表达载体。pLVX-Tet-On 上具有受dox 调控的转录激活因子rtTA。当添加dox 诱导rtTA 的表达后，rtTA 可以激活pLVX-Tight-Puro 上的四环素操作子，从而诱导操作子下游的蛋白表达。人源SMAD2和SMAD3的开放阅读框被克隆到pLVX-Tight-Puro 载体中。替换pLVX-Tet-On 中的CMV 启动子为pGK 启动子，防止其 在ESC 中 沉 默［19］。在HEK293T 细 胞 中，利 用Lipofectamine2000 将病毒包装质粒（psPAX2、pMD2.G）、包 含 人 源SMAD2或SMAD3的pLVXTight-Puro 表达质粒以及pLVX-Tet-On 质粒，转入HEK293T 细 胞 中， 随 后 收 集 慢 病 毒， 感 染SMAD2KO 或SMAD3KO 细胞以实现外源性SMAD蛋白的过表达。

1.2.3 细胞培养以及诱导hESC 向DE 和NE 分化

hESC 贴壁培养在Essential 8 培养基中，待细胞长满后使用EDTA 按照一定比例传代，细胞培养皿用基底胶（Matrigel）包被。

（1）诱导hESC 向DE 分化 D0（代表多能性阶段）：用含Rock 抑制剂的Essential 8 培养基将hESC按照1×105个/孔铺于6 孔板中，培养过夜。D1（代表ME 阶段）：更换包含AC 和GSK-3抑制剂CHIR99021（CHIR）的Advanced RPMI内胚层分化培养基Ⅰ，培养1 d。D3 （代表DE 阶段）：更换添加AC 的Advanced RPMI 内胚层分化培养基Ⅱ［20-21］，每日更换新鲜培养基，培养2 d。收集D3细胞进行流式细胞检测和免疫荧光染色，鉴定SOX17、EOMES、CXCR4和SMAD2的表达。

（2）诱导hESC 向NE 分化 D0（代表多能性阶段）：利用含Rock抑制剂的Essential 8培养基将hESC按照5×105个/孔铺于6 孔板中，培养24 h。D1～D8（代表NE 阶段）：更换添加TGFβ 抑制剂SB431542 和BMP 抑制剂LDN193189 的Essential 6 培养基，每日更换新鲜培养基，培养8 d。收集D8细胞进行流式细胞检测和免疫荧光染色，鉴定PAX6、OCT4 和SOX1的表达。

1.2.4 RNA 的提取以及实时定量PCR 收取ME 分化过程中的D0 和D1 细胞，检测EOMES、FOXA2和GSC的RNA 表达水平。利用500 μL Trizol 裂解细胞，随后加入200 μL三氯甲烷，上下剧烈振荡15 s，室温静置10 min 后，4°C 12 000×g离心15 min。离心后，转移上层液体于新的1.5 mL EP 管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀后，室温静置15 min，4 ℃12 000×g离心15 min，可在EP 管底部观察到白色RNA 沉淀。去除上清液，用75%乙醇（DEPC 水配制）和无水乙醇分别洗涤1 次，晾干沉淀后加入DEPC 水 溶 解， 定 量。 用All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix （AT341，北京全式金生物）试剂盒将RNA 反转录为cDNA，随后在384孔板中进行实时定量PCR （real-time quantitative reverse transcription PCR， qRT-PCR）， 每 孔 加 入5 μL PowerUp™SYBR™Green预混液、1 μL 1 μmol/L 上游引物和下游引物、2.5 μL cDNA（1∶10 稀释）和1.5 μL ddH2O，在荧光定量PCR 仪（CFX384 Touch，美国Bio-Rad 公司）上检测。反应条件为Bio-Rad 荧光定量PCR 仪的PrimePCR 程序。qRT-PCR 所用引物的序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列Tab 1 Primer sequences for qRT-PCR

1.2.5 流式细胞术 向预先贴壁培养的hESC 中加入适量非动物源性重组酶TrypLE，消化细胞，使用含有血清的培养基重悬中和细胞，160×g离心5 min，用预冷PBS 清洗3 次。使用流式缓冲液稀释抗体和活细胞染料，重悬清洗后的细胞团块，利用抗体进行标记，避光4 ℃染色30 min 至1 h，随后通过流式细胞仪（MoFlo Astrios EQ， 美国Beckman Coulter 公司）检测不同抗体标记的蛋白荧光表达情况。

1.2.6 蛋白质印迹检测 分别收取适量未处理hESC（0 h），AC 和GSK-3 抑制剂CHIR 处理12、24、36、48 h 的hESC，SMAD2KO、SMAD3KO 细胞或者在SMADKO 细胞中过表达外源性SMAD 蛋白的细胞样品，利用RIPA 蛋白裂解液［20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）、1 mmol/L EDTA、1% 甘油、150 mmol/L NaCl、1% NP40、1% 脱氧胆酸钠］裂解细胞制备蛋白样品，通过Pierce™Coomassie Plus（Bradford）检测试剂进行蛋白定量后取适量蛋白样品进行SDSPAGE，采用湿式转膜法，5% BSA 溶液室温摇床封闭1 h，加入一抗，4 ℃摇床孵育过夜。1×TBST 洗3次，加入荧光二抗，室温避光孵育1 h，1×TBST 洗3次后显影成像，通过双色红外激光成像系统（Odyssey CLx，美国LI-COR 公司）分析蛋白荧光强度。

1.2.7 免疫荧光染色 培养hESC 至合适密度，1×PBS 洗涤1 次后用4%多聚甲醛固定细胞，1%Triton X-100 通透2 min，5% BSA 溶液室温封闭1 h，加入一抗4°C孵育过夜。1×TBST洗3次，加入荧光二抗，室温避光孵育1 h，1×TBST 洗3 次，加入荧光染料DAPI 复染标记细胞核，室温避光孵育15 min，1×TBST 洗3 次，使用荧光显微镜（ECLIPSE Ts2R，日本Nikon公司）采集图像。

1.2.8 iTranscriptome数据库分析 根据iTranscriptome［22］数据库（http：//www.itranscriptome.org/），对小鼠原肠胚运动E6.5～E7.5时期SMAD2和SMAD3的RNA表达进行分析并得到它们的表达分布模式图。

1.3 统计学方法

通过GraphPad Prism Version 9.0 软件进行统计学分析。所有实验均进行3 次以上独立重复，数据以均值±标准误差的形式表示。组间比较采用非配对t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 SMAD2和SMAD3在胚胎发育过程中的表达

SMAD2 和SMAD3 的蛋白序列高度相似，尤其是两者的MH1 结构域的序列具有>90%的一致性。但是，SMAD2 包含了2 段插入序列：一段是连接2个螺旋结构的环延伸序列；另一段是靠近β 发夹结构的高度保守的E3 插入序列（图1A）。在胚胎发育过程中，SMAD2 和SMAD3 具有不同的表达模式和丰度。iTranscriptome 数据库显示，小鼠原肠胚运动E6.5～E7.5 时期，Smad2的RNA 表达几乎遍布整个上胚层，相比之下，Smad3的RNA 表达水平不高且分布相对较局限（图1B）。hESC 需要TGFβ 信号来进行自我更新和分化。那么SMAD2 和SMAD3 的蛋白水平是否会在干细胞的不同阶段也呈现出表达上的差异？hESC 在AC 和GSK-3 抑制剂CHIR 的处理下向ME 分化。蛋白质印迹法（Western blotting）结果显示，SMAD2 在hESC 中的表达水平更高（图1C）。利用Odyssey 成像系统软件分析Western blotting 实验的荧光强度显示，在hESC 分化的前36 h，SMAD2 和SMAD3 的表达量比值可以达到3.5∶1～4.5∶1；当分化诱导达到48 h，SMAD3 的蛋白表达有所上调，SMAD2 和SMAD3 的表达量比值 接 近 于1.5∶1 （图1D）。因 此，SMAD2 和SMAD3 在hESC 中的表达比例与其在小鼠原肠胚运动时期的表达比例较为相似——SMAD2 是最主要表达的调控因子。

图1 SMAD2和SMAD3的表达模式Fig 1 Expression pattern of SMAD2 and SMAD3

2.2 单一敲除SMAD2 或者SMAD3 对hESC 多能性因子表达的影响

为了进一步研究SMAD2 和SMAD3 在hESC 中的功能，利用CRISPR/sgRNA 技术构建了SMAD2 KO 和SMAD3KO 细胞系。与野生型hESC 基因序列相比，SMAD2KO 细胞的4 号外显子丢失了7 bp 碱基，而SMAD3KO 细胞的9 号外显子丢失了101 bp碱基（图2A）。Western blotting 结果显示SMAD2 或SMAD3 蛋白分别在SMAD2KO 和SMAD3KO 细胞中被特异性敲除（图2B）。为了鉴定SMAD2敲除和SMAD3敲除对hESC 多能性的影响，对多能性因子OCT4 和SOX2 进行了免疫荧光染色。结果显示，SMAD2或SMAD3的敲除没有影响OCT4 和SOX2 的表达。这说明单一敲除SMAD2或SMAD3并不会影响hESC 多能性因子的表达（图2C）。但是，值得注意的是，在实验过程中，无法在hESC 中获得SMAD2和SMAD3的双敲除克隆（数据未显示）。推测这是因为同时敲除SMAD2和SMAD3将导致hESC 死亡。这说明TGFβ 至少需要通过一个SMAD2 或者SMAD3 转录因子来有效地维持hESC的多能性。

图2 单一敲除SMAD2或者SMAD3对hESC多能性因子表达的影响Fig 2 Influence of SMAD2 knockout or SMAD3 knockout on the expression of pluripotent factors in hESCs

2.3 SMAD2 敲除和SMAD3 敲除对hESC 向NE 分化的影响

既然SMAD2敲除和SMAD3敲除不会影响hESC的多能性，那么接下来将检测二者对于hESC 分化能力的影响。首先探究SMAD2 和SMAD3 是否在hESC向NE 分化的过程中扮演重要角色。通过从D1～D8 添加TGFβ 抑制剂SB431542 和BMP 抑制剂LDN193189可以诱导hESC向NE分化。第8日，通过流式细胞术分析发现，在野生型hESC、SMAD2KO和SMAD3KO细胞中，由PAX6 标记的NE 细胞群分布并无明显差异（图3A）。免疫荧光染色结果显示，与野生型hESC 相比，无论是SMAD2KO 还是SMAD3KO 细胞，多能性因子OCT4 的表达不变或者稍有下降，但是NE标志因子PAX6和SOX1的表达呈现出不同程度的上调（图3B）。这意味着SMAD2或SMAD3的敲除并不会影响hESC 向NE 的分化。相反，SMAD2KO细胞甚至呈现出比野生型hESC 更高的PAX6和SOX1的表达，表明SMAD2 缺失在某种程度上还促进了hESC向NE的分化。

图3 SMAD2敲除和SMAD3敲除对hESC向NE分化的影响Fig 3 Effect of SMAD2 knockout or SMAD3 knockout on the NE differentiation of hESC

2.4 SMAD2 敲除和SMAD3 敲除对hESC 向DE 分化的影响

通过上述实验已经证实SMAD2敲除和SMAD3敲除不影响hESC 向NE 分化，甚至SMAD2敲除还能促进部分NE 标志因子的表达。接下来，需要确定这是否与ME 分化受阻所导致的继发性NE分化增强有关。野生型hESC、SMAD2KO 和SMAD3KO 细胞分别受到GSK-3 抑制剂CHIR 和AC 处理1 d 后（D1）到达ME 阶段，继续添加AC 2 d使细胞分化到达DE阶段。收取D3 细胞进行流式细胞分析，野生型hESC 和SMAD3KO 细胞能有效表达DE 标志因子SOX17、CXCR4和EOMES，而SMAD2KO 细胞中几乎没有发现SOX17 和EOMES 双 阳 性 或 者SOX17 和CXCR4 双阳性的细胞（图4A）。同时，免疫荧光染色实验证实，SOX17 和SMAD2 在SMAD2KO 细胞中没有表达，而在SMAD3KO 细胞与野生型hESC 中均有表达（图4B）。这一结果说明，SMAD2，而非SMAD3，在hESC 向DE 的分化过程中参与调控DE 相关基因的表达。同时，也说明SMAD2KO 细胞向DE 分化受阻，因此才会出现部分代偿性的NE分化。

图4 SMAD2敲除和SMAD3敲除对hESC向DE分化的影响Fig 4 Effect of SMAD2 knockout or SMAD3 knockout on the DE differentiation of hESC

2.5 过表达外源性SMAD2 对SMAD2KO 细胞向ME分化的影响

上述分析结果已表明SMAD2敲除会影响DE标志因子的表达。接下来，需要验证SMAD2KO 细胞是否早在ME 阶段就出现了分化异常。分别收集野生型hESC以及2种SMAD缺失细胞在GSK-3抑制剂CHIR和AC处理前（D0）和处理1 d后（D1）到达ME阶段的RNA，并通过qRT-PCR实验对ME的标志基因进行检测。结果显示，与野生型hESC相比，SMAD2KO细胞中ME的标志基因EOMES、FOXA2和GSC的表达显著下降，证实SMAD2KO 细胞几乎无法诱导ME 基因的表达；同时，SMAD3敲除对ME分化基因表达的影响甚微（图5A）。那么SMAD2KO 细胞向ME 分化障碍，是否是由特异性缺失SMAD2导致的呢？利用Teton药物诱导表达系统在SMAD2KO和SMAD3KO细胞中分别过表达外源性的人源SMAD2和SMAD3，进而检测其向ME分化的能力。Western blotting结果显示，在SMAD2KO和SMAD3KO细胞中分别成功地诱导了SMAD2 和SMAD3 的表达（图5B）。qRT-PCR 结果显示，外源性SMAD2 可以几乎完全恢复EOMES、FOXA2以及GSC在SMAD2KO细胞中的表达；而在外源性SMAD3过表达前后，SMAD3KO细胞ME基因的表达水平差异没有统计学意义（图5C）。这些结果均说明，SMAD2和SMAD3对hESC向ME的分化调控存在差异；SMAD2 在hESC 向ME 分化的过程中扮演了至关重要的角色。

图5 过表达外源性SMAD2对SMAD2KO细胞向ME分化的影响Fig 5 Effect of overexpressing exogenous SMAD2 in SMAD2KO cells on the ME differentiation

3 讨论

TGFβ 家族的细胞因子及其下游的SMAD 信号转导通路是多细胞动物发育和组织再生的控制核心。许多遗传性和细胞性疾病都是由TGFβ 信号转导紊乱所造成。SMAD2和SMAD3是TGFβ信号下游公认的重要信号转导因子，与SMAD4 形成异源三聚体后入核调控下游基因的表达。除了SMAD2的MH1结构域包含一段E3 插入序列外，SMAD2 和SMAD3 的蛋白结构高度相似，但在调控干细胞分化、上胚层发育以及在病理情况下所介导的TGFβ 作用依然存在差异，而其中的调控机制尚不清楚［16，23］。在本研究中，我们发现SMAD2 和SMAD3 在hESC 的多能性阶段及分化的过程中，两者的表达水平均存在差异。敲除SAMD2或SMAD3不会影响多能性因子OCT4 和SOX2 的表达，也不会干扰hESC 向NE 的分化。有趣的是，SMAD2敲除足以阻断hESC 向ME 以及后续的DE 的分化，并引起部分SMAD2KO 细胞代偿性地向外胚层分化；而SMAD3敲除不会影响该分化过程。由此可见，SMAD2对于hESC向ME分化更为关键。

SMAD2和SMAD3对于ESC的干性维持和ME分化具有不同的调控作用。在一些情况下，SMAD2 与SMAD3 的功能有冗余现象，但是不少研究表明SMAD2 往往比SMAD3 具有更广泛的作用。例如，Th17 辅助性T 细胞的分化需要SMAD2 而不是SMAD3［24］。SMAD2或SMAD3缺失小鼠具有截然不同的表型。如果将SMAD3 重构到内源性SMAD2 位点，可以部分挽救SMAD2 缺失导致的小鼠胚胎致死［25］。此外，SMAD2 特有的高度保守的E3 插入序列可能是导致SMAD2 和SMAD3 功能差异的关键。在没有TGFβ 信号刺激的情况下，E3 序列能决定SMAD2 和SMAD3 在细胞内的定位：敲除SMAD2 中的E3 序列，会使SMAD2 像SMAD3 一样累积在细胞核中；反之，若将E3 序列插入到SMAD3 的MH1 结构域的相应位点，会使SMAD3 在细胞质中富集［15］。在小鼠ESC 中，从内源性的SMAD2 中移除E3 序列（S2ΔE3），可以有效地干扰类胚体对于外源性AC 的快速应答。并且，这类S2ΔE3 细胞注入小鼠囊胚中所形成的嵌合体具有明显的胚外中胚层异常，但是对胚胎本身的影响并不大［9］。

值得注意的是，与我们前期在小鼠ESC中的研究相比［9］，SMAD2的E3序列对于hESC的调控作用并不明显。敲除SMAD2 特有的E3 插入序列对于hESC 向ME分化的影响非常短暂和有限（数据未显示）。这些表型的差异可能与TGFβ在2种ESC中的作用状态不同有关。始发态hESC 中，TGFβ 信号已经被激活，SMAD2/3预结合在关键ME基因的启动子上［26］。而在原始态小鼠ESC中，SMAD3和先驱因子FOXH1预结合在ME 基因的启动子上，而SMAD2 则依赖于E3 序列积聚在细胞质中［9］。当TGFβ 信号启动分化时，SMAD2-SMAD4复合物迅速入核，与SMAD3-FOXH1汇合并激活ME基因的转录。这进一步强调了SMAD2的E3插入序列作用的精确性和时效性［9］。

综上所述，SMAD2 和SMAD3 在结构上高度相似，但主要是SMAD2，而非SMAD3，决定了hESC在TGFβ 信号的诱导下向ME 分化。这种功能上的差异可能并不是完全由SMAD2特有的E3插入序列所导致，其背后的分子作用机制仍需要更深一步的探索。阐明TGFβ信号通路中SMAD2和SMAD3差异性调控ESC 分化的原因，将有助于理解TGFβ 信号通路的机制与功能，进而为胚胎发育生物学、干细胞研究和疾病治疗提供坚实的理论基础和新的思考方向。

利益冲突声明/Conflict of Interests

所有作者声明不存在利益冲突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

作者贡献/Authors'Contributions

赵冰楠主要完成细胞培养与分子实验的工作，马双羽主要完成流式分析与免疫荧光染色的工作，胥春龙主要进行实验指导与数据分析整理，王琼主要负责论文整体构思与文章撰写。所有作者均阅读并同意了最终稿件的提交。

ZHAO Bingnan performed the cell culture and molecular experiments.MA Shuangyu conducted the flow cytometry analysis and immunofluorescence staining experiments. XU Chunlong guided this project and conducted data analysis. WANG Qiong designed and supervised the project and wrote the manuscript. All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-01-19

·Accepted：2022-04-10

·Published online：2022-04-28