清心止悸颗粒指纹图谱及多成分含量测定研究

王艺璇，钱锋，周杰，韩莫暄，黄青，郑明善

（1.延边大学生物教研室，吉林 延吉 133002；2.吉林省中医药科学院中药药效物质基础重点实验室，吉林 长春 130012；3.吉林省中医药科学院第一临床医院，吉林 长春 130012；4.长春中医药大学，吉林 长春 130117）

冠心病室性早搏是临床最常见的心律失常，轻则可诱发明显的心悸、胸闷，重则可诱发室速、室颤。这种心律失常不仅会影响患者的生活质量，而且与猝死密切相关。有资料显示，室性早搏是心源性猝死的一个重要预测指标，约83%的猝死病人有室性早搏病史。频发室性早搏可以降低心功能而引起心力衰竭，增加病死率。室性早搏严重影响人们的健康，威胁患者的生命，因此，积极寻找安全有效的控制冠心病患者室性早搏的药物，缓解病人的症状，提高其生活质量，改善预后，具有非常重要的意义。清心止悸颗粒是源于古代经典名方及现代名老中医临床经验总结出治疗冠心病室性早搏的院内协定处方，前期对这种中药的组方和提取工艺等进行了初步研究，具有一定的前期基础。制剂由瓜蒌、黄连等9 味重要中药材组成。瓜蒌[1]善于清降上焦痰热，黄连[2]善泻上焦心火，与瓜蒌相伍，一化痰一泻火，共为君药；竹茹[3]既可清热化痰，增强瓜蒌清热化痰作用，又有宁神作用；陈皮、枳实[4]皆理气化痰之良药，三者为臣药；郁金、丹参[5]与诸多祛痰药相伍更可凉血清心，安神定悸，共为佐助药；甘草[6]既可泻火安神又能调和药性，为方中佐使药。

老年人、久病体虚及冠脉介入术后的病人多存在阴虚证侯，临床气阴两虚兼血瘀证型较为多见。以益气养阴，活血化瘀法选药组方，并在临床工作中不断总结、改进、精炼而确定清心止悸院内协定处方，临床应用多年，疗效明显。本研究首次建立了清心止悸颗粒的指纹图谱，采用HPLC法结合聚类分析及主成分分析，客观反映了清心止悸颗粒化学成分的整体性和制备工艺的稳定性。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20AT 岛津高效液相色谱仪（日本岛津科技）；KQ-300DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；分析天平万分之一FA2004N天平YUEPING上海越平科学仪器（苏州制造有限公司）；十万分之一METTLER TOLEDO AG245 瑞士。

1.2 试药

对照品：丹酚酸B（生产厂家批号：111562-201716，96.6%）；盐酸小檗碱（批号：110713-201814，86.8%）；橙皮苷（批号：110721-201617，96.1%）；甘草苷（批号：111610-201607，96.1%）；芦丁（批号：100080-201610，92.6%）；辛弗林（批号：110727-201809，99.5%）；新橙皮苷（批号：111857-201703，99.2%）；柚皮苷（批号：110722-201714，93.4%）以上对照品均来自于中国食品药品检定研究院。清心止悸颗粒由吉林省中医药科学院的制剂室提供；HPLC定量分析中使用的乙腈、甲醇为色谱级，水为超纯水。

2 指纹图谱研究

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 取丹酚酸B、盐酸小檗碱、橙皮苷、甘草苷、芦丁、辛弗林、新橙皮苷、柚皮苷对照品适量，分别加甲醇制成0.2 mg/mL 的对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取15 批清心止悸颗粒中试样品，研细，取约4 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇50 mL，称定重量，超声提取30 min后，放冷，再称定重量，补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

2.1.3 各药材供试品溶液的制备 按处方量称取瓜蒌、黄连、竹茹、枳实、陈皮、茯苓、丹参、郁金、甘草，加水按提取工艺提取，得到浸膏粉末，研细，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇50 mL，称定重量，超声提取30 min后，放冷，再称定重量，补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

2.2 色谱条件

色谱柱：岛津VP-ODS（4.6 mm 150 mm，5m），检测波长280 nm，柱温30 ℃，流速1.0 mL/min，进样量5L。流动相：乙腈（A）-0.2%磷酸水（B），梯度如表1。

表1 流动相梯度表Table 1 Mobile phase gradient table

3 方法学考察

3.1 精密度

取清心止悸颗粒（批号：20210201），按2.1.2 项制备供试品溶液，按上述色谱条件，连续进样6 次，计算21 个共有峰的相对峰面积和相对保留时间的RSD值均小于5%，结果符合指纹图谱的分析要求，证明仪器精密度良好，见表2 和表3。

表2 精密度（相对峰）面积RSD 值Table 2 RSD values of precision(relative peak area)

表3 精密度（相对保留时间）RSD 值Table 3 RSD values of precision(relative retention time)

3.2 稳定性

取清心止悸颗粒（批号：20210201），按2.1.2 项制备供试品溶液，按上述色谱条件，分别在0 h、4 h、8 h、12 h、16 h和24h 时进样，计算21个共有峰的相对峰面积和相对保留时间的RSD 值均小于5%，结果符合指纹图谱的分析要求，证明该方法条件下稳定性良好，见表4和表5。

表4 稳定性（相对峰面积）RSD 值Table 4 RSD of the stability(relative peak area)

表5 稳定性（相对保留时间）RSD 值Table 5 RSD values of the stability (relative retention time)

3.3 重复性

取同一批清心止悸颗粒（批号：20210201），按2.1.2项平行制备供试品溶液6 份，按上述色谱条件，计算21 个共有峰的相对峰面积和相对保留时间的RSD值均小于5%，结果符合指纹图谱的分析要求，证明该方法重复性良好，见表6 和表7。

表6 重复性（相对峰面积）RSD 值Table 6 RSD values of the repeatability (relative peak area)

表7 重复性（相对保留时间）RSD 值Table 7 RSD values of the repeatability (relative retention time)

4 指纹图谱的建立

应用上述指纹图谱条件，对15 批清心止悸颗粒（20210201/20210202/20210203/20210204/20210205/2 0210206/20210207/20210208/20210209/20210210/202 10211/20210212/20210213/20210214/20210215）进行测定。将所得图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.130723），以S1 为参照图谱，采用多点校正，按照平均值法建立了清心止悸颗粒的HPLC 指纹图谱，280 nm 下生成13 个共有峰，见图1。

图1 清心止悸颗粒15 批中试样品的HPLC 指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprints for 15 batches of pilot test samples of Qingxinzhiji Granules

4.1 相对保留时间和相对峰面积结果

在280 nm 波长下确定了13 个共有峰，生成对照指纹图谱，共有峰中8 号峰峰面积大，分离度好，故选为参照峰。相对保留时间和相对峰面积测定结果，见表8 和表9。

表8 15 批清心止悸颗粒相对保留时间RSD 值Table 8 15 RSD values of the relative retention time of Qingxinzhiji granules

表9 15 批清心止悸颗粒相对峰面积RSD 值Table 9 15 RSD values of relative peak area of Qingxinzhiji granules

4.2 相似度评价

将测定的15 批清心止悸颗粒指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.130723），对照指纹图谱的相似度均大于0.9，各自相关系数均在0.87以上，相似度结果见表10。

表10 15 批样品相似度Table 10 Similarity of 15 sample

4.3 药材在指纹图谱中的贡献情况

将2.1.3 项下的各药材供试品按上述色谱条件分别进样，按S1 为对照图谱筛选共有峰。在280 nm 下13 个共有峰中，贡献的药材有瓜蒌、黄连、竹茹、枳实、陈皮、丹参和甘草。茯苓[7,8]主要成分为多糖，郁金[9]主要成分为挥发油和淀粉，故未能贡献，见图2、表11。

图2 药材的贡献情况Fig.2 Contribution of Medicinal materials

表11 药材的贡献情况Table 11 Contribution of crude drugs

4.4 色谱峰的确定

将2.1.1 项下的盐酸小檗碱、橙皮苷、芦丁、辛弗林、新橙皮苷和柚皮苷对照品，按上述色谱条件分别进样，以S1 为对照色谱。推断1 号和2 号峰含有辛弗林，4 号峰为芦丁，7 号峰为柚皮苷，8 号峰为橙皮苷，9 号峰为新橙皮苷，10 号峰为盐酸小檗碱，见图3。

图3 对照品指认情况Fig.3 Reference substance identification

辛弗林纯度为99.5%，经梯度洗脱分离出两个色谱峰，用2020 版药典方法验证，如图4 所示。疑似辛弗林同分异构体，两峰同属辛弗林。但因表11 显示所有药材中均含有1 号峰，而文献并不支持辛弗林在以上药材中均存在，同时，1 号峰保留时间过短，仅为2 min左右，受到的干扰较多，故无法确认1 号峰和2 号峰为辛弗林。

图4 辛弗林药典方法和梯度洗脱图Fig.4 The pharmacopoeia test method of Synephrine and the gradient elution diagram

4.5 聚类分析

将15 批清心止悸颗粒的绝对共有峰面积导入SPSS 22.0 软件，进行系统聚类分析，选用组内连接的聚类方法，Euclidean 距离为测量区间，得到指纹图谱聚类分析图，如图5。当欧式距离介于15~25 之间时15 批样被明显分为2 类，其中1、4、6、7、10、11、12、13、14 和15 划为一类，2、3、5、8 和9 为另一类。此数据说明大部分样品质量类似，指纹图谱所筛选的共有峰可以稳定表达质量传递情况。证明清心止悸颗粒的生产工艺稳定。

图5 15 批清心止悸颗粒聚类分析图Fig.5 15 Cluster analysis of Qingxinzhiji granules

4.6 主成分分析

以13 个共有峰峰面积为变量，采用SPSS 22.0 软件对15 批清心止悸颗粒样品进行主成分分析，计算主成分特征值及累计方差贡献率，见表12。提取特征值>1 的2 个主成分，其累计方差贡献率为85.911%，代表了样品中13 个成分的大部分信息，具有很好的代表性。因子载荷矩阵见表13，13 个共有峰中除了色谱峰3、4、6、8、10、11 号与主成分1 呈负相关外，其余均为正相关，对主成分1 的贡献较大；色谱峰5 与主成分2 呈负相关外，其他均贡献主成分2。

表12 15 批清心止悸颗粒的特征值表Table 12 15 characteristic values of Qingxinzhiji granules

图6 15 批清心止悸颗粒的特征值散点图Fig.6 15 Scattering diagram of characteristic values of Qingxinzhiji granules

表13 主成分因子载荷矩阵Table 13 Principal component factor load matrix

5 含量测定

5.1 色谱条件

色谱柱为岛津VP-ODS（4.6 mm 150 mm，5m），检测波长280 nm，柱温30 ℃，流速1.0 mL/min，进样量5L。流动相为乙腈（A）-0.2%磷酸水（B）梯度洗脱：0~6 min，2%~5.2%A；6~12 min，5.2%~10%A；12~17 min，10%~15% A；17~35 min，15%~28% A；35~45 min，28%~32.5%A；45~50 min，32.5%~40%A。

5.2 溶液的制备

5.2.1 对照品溶液的制备 取芦丁4.4 mg、橙皮苷10.3 mg 和盐酸小檗碱1 mg，加甲醇100 mL 制成混合对照品溶液。

5.2.2 供试品溶液的制备 取清心止悸颗粒中试样品，研细，取约4 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇50 mL，称定重量，超声提取30 min 后，放冷，再称定重量，补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

5.3 线性关系的考察

表14 3 种成分线性关系Table 14 Linear relationship of the four components

5.4 精密度试验

5.5 稳定性试验

5.6 重复性试验

取同一批次清心止悸颗粒适量，按5.2.2 项下方法独立制备供试品溶液6 份并依法测定，芦丁、橙皮苷和盐酸小檗碱含量的RSD 分别为3.62%、3.43%和2.82%，证明此方法重复性良好。

5.7 加样回收率试验

取同一批次含量清心止悸颗粒6 份，分别加入各对照品适量，按5.2.2 项下制备，按5.1 依次测定，计算芦丁、橙皮苷和盐酸小檗碱平均加样回收率分别为98.16%、98.52%和98.19%，RSD 分别为2.34%、2.77%和1.48%，符合方法学要求。

5.8 样品含量测定

取15 批清心止悸颗粒，按5.2.2 项下制备，按5.1色谱条件测定芦丁、橙皮苷和盐酸小檗碱，结果见表15。

表15 15 批清心止悸颗粒样品3 种成分含量测定结果（mg·g-1）Table 15 15 Determination results of 4 components in Batches of Qingxinzhiji granule samples(mg·g-1)

6 讨论

中成药院内制剂，其化学成分极为复杂。为尽可能地在一张色谱图上更好反映出各组方中药的信息，对检测波长、提取溶剂、色谱柱及色谱流动相进行了考察。

6.1 检测波长

清心止悸颗粒由9 味中药组成，含黄酮类成分较多，经查阅文献常以280 nm 进行检查，经过检测器对所有色谱峰在210 nm、254 nm、280 nm 和346 nm 波长范围进行扫描，210 nm 检测波长下基线不平，254 nm和346 nm 检测波长下色谱峰少且分离度低，故选择280 nm 作为检测波长[10-15]。

6.2 提取溶剂

取清心止悸颗粒中试样品3份，研细，每份约取4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加70%甲醇、80%甲醇、100%甲醇50 mL，称定重量，超声提取30 min后，放冷，再称定重量，补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。在280 nm检测波长下，相比70%甲醇、80%甲醇色谱峰少且分离度低，故选用100%甲醇为提取溶剂。

6.3 色谱柱

取3 种色谱柱岛津VP-ODS（4.6 mm 150 mm，5m）；岛津VP-ODS（4.6 mm 250 mm，5m）；安捷伦SB-C18（4.6 mm 150 mm，5m），在280 nm 检测波长下岛津VP-ODS（4.6 mm 150 mm，5m）分离效果好且分离时间短，故选用色谱柱岛津VP-ODS（4.6mm 150 mm，5m）。

6.4 色谱流动相

7 结论

本研究首次建立了清心止悸颗粒指纹图谱，15 批中试样品相似度在0.87 以上，检测到13 个共有峰，确认了其中8 个峰，并测定了芦丁、橙皮苷和盐酸小檗碱3 种成分含量。综上所述，本实验建立的方法方便、快捷、重现性好，可为质量标准及质量控制研究提供理论基础。