山羊CHRNA7 和CRYM 基因多态性与产羔性能的关联分析

余平，狄冉，江炎庭，杨红远，洪琼花※，储明星※

（1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，农业农村部动物遗传育种与繁殖重点实验室，北京 100193；2.云南省畜牧兽医科学院，云南 昆明 650224）

山羊（Capra hircus）作为最古老的家养动物之一，也是世界上最重要的畜牧业品种之一，能为人类提供稳定的肉、奶和毛皮等生活物资，在畜牧养殖业中占据重要地位[1]。我国山羊品种多、存栏量大，但繁殖力低、生长速度慢等因素依然长期制约着山羊产业发展[2]。山羊产羔性状即产羔数和窝重情况（初生窝重和断奶窝重）作为衡量母羊生产性能的重要指标，与群体的繁衍速度和规模密切相关，是山羊生产中的重要经济性状，直接影响着养羊业的经济效益。但羊产羔数性状受外界因素影响较大，遗传力很低，山羊仅为0.14 左右[3,4]，因此通过相关候选位点的发掘等方法和寻找更有效、更关键的分子标记，对山羊进行分子标记辅助选择育种，进而提高山羊产羔数等性状具有重要现实意义[5]。

乙酰胆碱（ACh）是主要神经递质之一，其受体分为两种，即烟碱型受体（nAChRs）和毒蕈碱型受体（mAChRs）。nAChRs是介导突触间快速信号传递的五聚体配体门控离子通道，由 和 跨膜亚基构成的不同组合组成[6]，不同的亚单位构成不同的亚型，同时也表现出不同的生理学和药理学性质。目前已经确认有5 种具有不同功能的nAChR 亚型存在，7 亚型作为中枢神经系统中分布最为广泛的亚型之一，也是最为特殊的一个，它由定位于15 号染色体长臂14 区（15q14）、全长185 kb[7]的CHRNA7 基因编码，由5 个相同的亚基构成，也称为CHRNA7，具有高钙离子通透性[8]。尽管CHRNA7 的分布与其他nAChRs 亚型有很大的重叠，但其分布是最广泛的，在下丘脑、海马和丘脑等区域有比较密集的分布，在纹状体、前脑、髓质和各种脑核中的分布则比较稀疏[9]，同时，其在神经、免疫、循环、呼吸及生殖系统中也可以检测到[10]-晶体蛋白（CRYM，也称为“M-Crystallin”M-晶体素）是一种种属特异性的35-KDA蛋白，在袋鼠晶状体中大量表达[11]，亦在人视网膜、脑、心脏和肾脏中高度表达。Southern印迹分析表明编码CRYM mRNA 和-结晶蛋白的基因位于人类基因组的16p12.2，在小鼠中位于7QF2[12]。CRYM 是胞质中依赖于NADPH 的甲状腺激素结合蛋白，其酮亚胺还原酶可以改变甲状腺素（TSH）在细胞中的浓度，甲状腺激素是基因表达和代谢的必要调节因素，在体内生理调节中具有重要作用，酮亚胺还原酶作为参与氨基酸代谢的酶类，也具有调节其他激素和小分子活性的功能，进而能影响多种生理进程，其精确调控对于维持稳态和适应不同的环境条件至关重要[13]。Tao L 等[14]的研究结合基因组方法，鉴定了一些包括CRYM 在内的参与山羊卵巢功能调节和季节性繁殖相关的候选基因，有助于对山羊繁殖性状遗传构成进行综合评估。所以我们猜测CHRNA7 和CRYM 基因与羊的繁殖性能有关系。

云上黑山羊是以云岭黑山羊为母本、努比山羊（黑色个体）为父本进行杂交选育，并采用胚胎移植等繁育新技术，经过20 多年培育而成的我国第1 个肉用黑山羊品种[15]，具有肉质鲜美、生长快及母羊四季均可发情且产羔率较高等优点；济宁青山羊和辽宁绒山羊也是繁殖能力较强、包含丰富遗传资源的山羊品种，具有繁殖选育的潜力。本研究选用这3 个山羊群体作为研究对象，旨在分析CHRNA7 基因和CRYM 基因在3 个山羊群体中的遗传多态性及其与产羔性能的关联，以期为山羊分子育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集和表型记录

本研究对768 只2~5 岁的母羊（云上黑山羊544只、济宁青山羊133 只和辽宁绒山羊91 只）颈静脉血液（10 mL/只）进行了采集，并通过酚氯仿法提取其基因组DNA。本试验的云上黑山羊来自云南红河哈尼族彝族自治州，拥有至少1 胎产羔数的记录，其中大部分拥有初生窝重和断奶窝重（3 月龄）记录；济宁青山羊来自农业农村部济宁青山羊保种基地（山东省嘉祥县）；辽宁绒山羊则选自辽宁绒山羊育种中心（辽宁省辽阳市）。济宁青山羊和辽宁绒山羊没有具体产羔数记录。本试验中视济宁青山羊为高繁殖力群体，视辽宁绒山羊为低繁殖力群体[16]。

1.2 基因分型

利用Sequenom MassARRAY SNP 分型技术[17]对CHRNA7 和CRYM 基因候选位点（CHRNA7 g.29127669 G ＞A、CHRNA7 g.29206216 C ＞T、CRYM g.18929936 G ＞A 和CRYM g.18929951 A ＞G）进行分型检测和分析。每个分型样品DNA需要量为 20L，DNA 浓度40~80 ng/L。相关引物信息见表1。

表1 用于分型的引物Table 1 primers used for typing

1.3 统计分析

应用Microsoft Excel 软件，对CHRNA7 和CRYM基因4 个多态位点的基因频率、基因型频率、有效等位基因数（NE）、杂合度（HE）、多态信息含量（PIC）和等位基因频率（Ne）进行统计。本研究利用卡方检验进行Hardy-Weinberg 平衡检验并探索候选位点基因型与品种（高繁品种：济宁青山羊；低繁品种：辽宁绒山羊）之间的关系。计算出产羔数和窝重的平均数后，采用单因素方差分析的方法分析基因型的效应，采用Tukey 法进行多重比较，应用IBM SPSS Statistics 统计软件中的一般线性模型对云上黑山羊基因型与产羔数表型数据进行关联分析，所有数据均以平均值±标准误形式表示，P ＜0.05 表示差异显著，P ＜0.01 表示差异极显著。

2 结果

2.1 CHRNA7 和CRYM 基因多态性分析

由基因分型结果（图1）可知，两个基因的4 个候选位点均存在多态性。在云上黑山羊、济宁青山羊和辽宁绒山羊中，CHRNA7 基因的g.29127669 G ＞A 位点存在AG 和GG 两种基因型，g.29206216 C ＞T 位点存在3 种基因型，分别是CC、CT 和TT；CRYM 基因的g.18929936 G ＞A 位点存在AG 和GG 两种基因型，g.18929951 A ＞G 位点存在的两种基因型为AA 和AG。

图1 基因分型结果Fig.1 Genotyping results of genes

群体遗传学分析（表2）表明，CHRNA7 基因g.29127669 G ＞A 位点在云上黑山羊、辽宁绒山羊和济宁青山羊群体中均为低度多态（PIC ＜0.25），CHRNA7g.29206216C ＞T 位点在3个群体中均为中度多态性（0.25＜PIC＜0.5）；CRYM 基因g.18929936G ＞A位点在云上黑山羊、辽宁绒山羊和济宁青山羊3 个群体中均为低度多态，CRYM 基因g.18929951 A ＞G位点在济宁青山羊群体中为中度多态，而在云上黑山羊和辽宁绒山羊群体中为低度多态。卡方检验表明，CHRNA7 和CRYM 两个基因的4 个候选位点在3个山羊群体中均处于Hardy-Weinberg 平衡状态（P ＞0.05）。

表2 候选位点在3 个山羊品种中的群体遗传学分析Table 2 The population genetic analysis of the candidate loci in three goat breeds

2.2 候选位点与繁殖性能的关联分析

如表3 所示，CHRNA7 基因的g.29127669 G ＞A 和g.29206216 C ＞T 两个位点在不同繁殖力品种（JN和LN）中的基因型分布均无显著差异（P＞0.05），但CRYM 基因g.18929936 G ＞A 位点在不同繁殖力品种中的基因型分布存在极显著差异（P ＜0.01），CRYM 基因g.18929951 A ＞G 位点在不同繁殖力品种中的基因型分布也存在着显著差异（P ＜0.05）。

表3 候选位点基因型与不同繁殖力品种的卡方检验Table 3 Chi-square test for genotypes of candidate loci and Varieties with different fecundity

对云上黑山羊基因型与产羔数等表型数据进行关联分析的结果（表4）表明，CHRNA7 基因的g.29127669 G ＞A 和g.29206216 C ＞T 位点及CRYM 基因的g.18929951A ＞G 位点的各基因型对产羔数均无显著影响（P ＞0.05）；但CRYM 基因g.18929936 G ＞A 位点AG 型的产羔数显著高于GG 型（P ＜0.05）；所有候选位点的各基因型对初生窝重均无显著影响（P ＞0.05）；但CHRNA7 基因g.29206216 C＞T 位点的CC 型的断奶窝重显著高于CT 和TT 型（P＜0.05），CT 型与TT 型的断奶窝重则无显著差异；同时CRYM 基因g.18929936 G ＞A 位点的AG 型的断奶窝重也显著高于GG 型（P ＜0.05）。

表4 CHRNA7 和CRYM 对云上黑山羊产羔性能的影响（平均数±标准误）Table 4 Effects of CHRNA7 and CRYM on the lambing performance of Yunshang black goat (mean±standard error)

3 讨论

3.1 CHRNA7基因多态性与动物繁殖性能的关系

nAChR 是一种内膜蛋白，可结合神经递质烟碱型乙酰胆碱。选择性的 7nAChR（CHRNA7）配体能识别烟草的主要成分乙酰胆碱和病理效应的关键因子烟碱尼古丁（NT）[18]，由于CHRNA7 分布广泛，其涉及到众多功能，包括生长、突触可塑性、神经递质释放和免疫应答性，进而对机体的许多行为起着调节作用，也与包括阿尔茨海默症和帕金森等在内的多种疾病有关系[19]，有研究发现，抑郁症相关的行为会因提高海马中 7nA ChR 的含量而得到调节，从而认为CHRNA7 可能与抑郁症的发生存在密切的联系[20]。 这些结果表明，7nAChR有发展成为治疗炎症、败血症、精神分裂症和认知障碍等疾病药物的潜力[21]。有研究相继发现在巨噬细胞、单核细胞和淋巴细胞中存在 7nAChR[22]，也有越来越多的研究表明，7nAChR是包括宫颈癌在内的多种癌症的潜在治疗靶点[23]。CHRNA7 是编码7nAChR 的关键基因，调节细胞信号转导，在不同的非神经元细胞中均有不同程度的表达[24]。但关于该基因在山羊繁殖性能方面是否产生影响未见报道。本研究中，CHRNA7 基因g.29127669 G ＞A 位点在云上黑山羊、辽宁绒山羊和济宁青山羊群体中均为低度多态（PIC ＜0.25），CHRNA7g.29206216 C ＞T位点在3个群体中均为中度多态性（0.25 ＜PIC＜0.5）；卡方检验表明，CHRNA7 基因的2 个候选位点在3 个山羊群体中均处于Hardy-Weinberg平衡状态（P＞0.05）。云上黑山羊中基因型与产羔数等表型关联分析的结果表明，CHRNA7 基因的g.29127669 G ＞A 和g.29206216 C ＞T 位点各基因型对产羔数均无显著影响（P ＞0.05），但g.29206216 C ＞T 位点的CC 型个体断奶窝重显著高于CT 和TT 型（P ＜0.05），CT 型与TT 型的断奶窝重则无显著差异。

3.2 CRYM 基因多态性与动物繁殖性能的关系

本研究中，CRYM 基因的g.18929936 G ＞A 位点在云上黑山羊、辽宁绒山羊和济宁青山羊3 个群体中均为低度多态（PIC ＜0.25），g.18929951 A ＞G 位点在济宁青山羊群体中为中度多态（0.25 ＜PIC＜0.5），而在云上黑山羊和辽宁绒山羊群体中为低度多态。卡方检验表明，CRYM 基因的2 个候选位点在3 个山羊群体中均处于Hardy-Weinberg平衡状态（P＞0.05）。云上黑山羊中的关联分析结果表明，CRYM 基因的g.18929951 A ＞G 位点的各基因型对产羔数均无显著影响（P ＞0.05），但g.18929936 G ＞A 位点AG 型的产羔数显著高于GG 型（P ＜0.05）；2 个候选位点的各基因型对初生窝重均无显著影响（P ＞0.05），但g.18929936 G ＞A 位点的AG 型的断奶窝重也显著高于GG 型（P ＜0.05）。

4 结论

CHRNA7 基因的2 个位点g.29127669 G ＞A 和g.29206216 C ＞T 均不适合作为云上黑山羊产羔性能的分子标记，但CHRNA7 基因g.29206216 C ＞T 位点可以用于断奶窝重的选择；CRYM 基因g.18929951 A＞G 位点不适合用于产羔性能的选择，而CRYM基因g.18929936 G ＞A 位点可作为云上黑山羊产羔数选择的潜在分子标记，同时也适合断奶窝重的选择。