基于网络药理学探讨青风藤 穿山龙药对治疗强直性脊柱炎的作用机制

赖楚儿，王义军

（1.北京中医药大学，北京 100029；2.中国中医科学院望京医院，北京 100102）

强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis,AS）是一种炎症性自身免疫性疾病，发病与遗传和细菌感染等环境因素相关，以中轴关节、韧带和肌腱受累产生非特异性炎症、纤维化及骨化为主要表现。临床症状典型为腰背疼痛和晨僵，后期随着脊柱关节破坏、融合可出现脊柱僵直和畸形。西医药物治疗主要是NSAIDs、DMARDs和bDMARDs（TNF 抑制剂）等[1-3]。在我国患病率约为0.3%[4]。中医认为AS 属于痹病范畴，发病以正虚为本，肾虚及督脉空虚是根本病因，风湿、瘀血、痰浊及湿热等是阻滞经脉，造成疼痛、僵硬，影响病情发展的重要原因，为标。

青风藤 穿山龙药对是胡荫奇教授治疗强直性脊柱炎的经验用药[5]，特别适用于寒湿痰瘀痹阻所致的腰背疼痛。青风藤味苦、辛，性平，入肝、脾经，主要功用是祛风湿、通经络，此外还有通利小便的作用；穿山龙味甘、苦，性温，归肝、肾、肺经，与青风藤同有祛风除湿、舒经通络之功效，兼可活血止痛[6]。两药相须为用，辛开苦泄，温通肝肾之经，加强祛风通络之功效。本研究基于网络药理学，探究青风藤 穿山龙药对治疗强直性脊柱炎的可能靶点及作用机制，为中医药治疗强直性脊柱炎提供理论参考。

1 资料与方法

1.1 青风藤 穿山龙化学成分筛选

通过中药系统药理数据库及分析平台（TCMSP）数据库（http://tcmspw.com/tcmsp.php）[7]，分别以中药名搜索青风藤和穿山龙，获得中药化学成分。根据ADEM筛选有效活性成分，筛选条件为口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18。另外根据文献补充药物有效成分。

1.2 化合物疾病靶点筛选

在TCMSP 平台下载中药有效成分的化学结构图，以.Mol 格式导入PharmMapper 服务器[8-10（]http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/），据成分化学结构预测作用靶点，目标集为“Human Protein Targets Only”，获得的靶点数据，选择Norm Fit＞0.5 的蛋白质靶点，将其UniplotID 导入Untprot 数据库（https://www.uniprot.org/）[11]，获得对应的化合物疾病基因靶点。

1.3 强直性脊柱炎疾病靶点筛选

在在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM，https://omim.org）、DrugBank 疾病靶点筛选数据库[12]（https://www.drugbank.ca/）和GeneCards数据库[13（]https://www.genecards.org/）输入疾病名称“ankylosing spondylitis”，获得疾病靶点数据。疾病基因经Unprot数据库规范化处理，用疾病靶点与成分靶点绘制韦恩图，获得成分疾病交集基因。

1.4 药物 成分 疾病 靶点网络

将青风藤 穿山龙药对治疗AS 的成分-疾病基因数据导入Cytoscape 3.7.2 软件[14]进行可视化分析，构建出“药物 成分 靶点 疾病”网络图。

1.5 构建蛋白质相互作用（PPI）网络

在String 功能性蛋白质关联网络数据库[15]（https://string-db.org/）导入成分 疾病交集基因，隐藏网络无联系的节点，设定最低交互评分为0.4，构建PPI（protein-protein interaction network）网络。据PPI 网络数据用Cytoscape 3.7.2 软件进行可视化分析，根据Degree值筛选出PPI 网络中的关键基因（Hub 基因），构建关键基因PPI 网络。

1.6 基因本体（Gene ontology，GO）富集分析

GO 富集分析包括包括生物过程（Biological process, BP）、细胞组分（Cellular component, CC）和分子功能（Molecular function,MF）3 方面。在Metascape[16]（https://metascape.org/）数据库导入交集基因，分别进行GOBP、GOCC 和GOMF 分析，P ＜0.01。

1.7 京都基因与基因组数据库（KEGG）通路富集分析

KEGG Pathway 分析通过基因富集分析得出关键通路。将交集基因导入Metascape，选择P ＜0.01 进行KEGG Pathway 分析，利用微生信平台（http://www.bioinformatics.com.cn/）绘制GO 富集柱状图及KEGG富集气泡图。

2 结果

2.1 青风藤-穿山龙化学成分筛选

在TCMSP 平台搜索获得化学成分，青风藤16个，穿山龙9 个，按OB≥30%，DL≥0.18 筛选后，共获得有效成分9 个，查阅文献[17]发现穿山龙中有效成分薯蓣皂苷元、纤细薯蓣皂苷已有与疾病相关研究，故补充这2 个成分，通过PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获得其成分结构信息，见表1。

表1 青风藤 穿山龙有效成分Table 1 The effective components of Caulis Sinomenii-Rhizoma Dioscoreae Nipponicae Herb Pairs

2.2 化合物疾病靶点筛选

在PharmMapper 服务器获得有效成分的蛋白质靶点，经Uniprot 数据库转化为基因靶点，获得青风藤成分的靶点基因573 个，穿山龙成分靶点基因954 个，去除重复基因，共获得青风藤 穿山龙药对有效成分靶点基因297 个。

2.3 强直性脊柱炎疾病靶点筛选

OMIM数据库获得AS靶点基因108 个；DrugBank疾病靶点筛选数据库获得AS疾病蛋白质靶点348 个，经Uniprot 转化为基因靶点；在GeneCards 数据库搜索AS疾病相关基因共2123个，按Relevancescore ＞1.08筛选，获得627个疾病靶点基因，将3个数据库所获得的疾病基因整合，去除重复项，得到816 个AS 靶点基因。通过Excel 函数获得成分 疾病交集基因56 个，并绘制韦恩图，见图1。

图1 青风藤 穿山龙药对与强直性脊柱炎交集基因韦恩图Fig.1 Intersection genes from the Venn diagram

2.4 药物 成分 疾病 靶点网络

将青风藤 穿山龙治疗AS 的成分 疾病基因导入Cytoscape 3.7.2 软件得到“药物 成分 交集靶点疾病”网络图，见图2。图中正方形代表疾病，正六边形代表药物，圆形代表药物有效成分，菱形代表青风藤穿山龙药对药物成分对应的基因靶点，三角形代表其与疾病交集基因，同时图形面积代表连结节点数，面积越大代表连结节点越多。

图2 药物 成分 靶点 疾病网络图Fig.2 TCM component target disease network

2.5 构建蛋白质相互作用（PPI）网络

在String 平台导入交集基因构建PPI 网络图，共有节点56 个，边数186 条，平均节点度（average node degree）6.64。经Cytoscape 可视化分析，隐去游离节点，见图3。其中圆圈表示基因节点，节点面积与连接度（Degree值）的大小成正比，节点之间连线的粗细与Combine score 的大小成正比。在Cytoscape 进行数据分析，根据Degree 值筛选关键基因（Hub 基因），选择Degree值前10 的基因构建关键基因PPI 网络。如图4 关键基因依次是ALB、IGF1、ESR1、AR、MMP2、F2、PPARG、IL2、CYP19A1 和NR3C1。

图3 交集基因PPI 网络图Fig.3 PPI network diagram of intersecting genes

图4 关键基因PPI 网络图Fig.4 PPI network diagram of hub genes

2.6 GO功能富集分析

GO 功能富集分析结果得到GOBP 739 条，GOCC 19 条，GOMF 79 条。按p-value 值从小到大筛选GOBP前20 条，GOCC 和GOMF 各前10 条，绘制富集柱状图，主要富集分析结果如图5。

图5 GO 功能富集图Fig.5 Histogram of GO functional enrichment analysis

2.7 KEGG通路富集分析结果

在Metascape 对交集基因进行KEGG 通路富集分析，共得到74 条通路，按P-value 值从小到大排列，去除癌症相关通路，取前25 条通路制作富集气泡图，见图6。结果显示，交集基因KEGG 通路主要富集如下：Steroid hormone biosynthesis（类固醇激素生物合成）、Ovarian steroidogenesis（卵巢类固醇生成）、Arachidonic acid metabolism（花生四烯酸代谢）、Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450（细胞色素P450 对异种生物的代谢）、PPAR signaling pathway（PPAR 信号通路）、Complement and coagulation cascades（补体和凝血级联）、foxo signaling pathway（foxo信号通路）、Endocrine resistance（内分泌抵抗）、Longevity regulating pathway（长寿调节通路）、HIF-1 signaling pathway（HIF-1 信号通路）、AMPK signaling pathway（AMPK信号通路）、PI3K-Akt signaling pathway（PI3K-Akt 信号通路）、Axon guidance（轴突导向）、T cell receptor signaling pathway（T 细胞受体信号通路）和insulin resistance（胰岛素抵抗）。

图6 KEGG 通路富集图Fig.6 Bubble diagram of KEGG functional enrichment analysis

3 讨论

3.1 中药与化学成分

现代药理研究发现，青风藤有调节免疫反应、抗炎、镇静、镇痛和降血压作用[18]。穿山龙具有明显的抗炎作用，此外还有镇痛、抗疲劳、抗氧化、降尿酸及耐缺氧作用[19]。青风藤和穿山龙两药配伍使用是胡荫奇教授治疗强直性脊柱炎的特色经验用药，用于治疗寒湿痰瘀痹阻型大偻。除此之外，王庆国[21]治疗强直性脊柱炎的经验方穿藤通痹汤中也有这两药相须为用，以藤类之属，可通经入络，通利祛邪[20]。温启宗认为青风藤与穿山龙配伍治疗大偻及其他痹症，可散风寒湿痹，活络止痛，善治腰背疼痛[21]。

薯蓣皂苷元（Dgn）的抗炎作用通过减弱多种酶活性和减少IL-1 诱导的炎性因子分泌抑制中性粒细胞活化及超氧化物形成[22]。调节免疫方面Dgn 促进巨噬细胞分泌，刺激M2 细胞分化和淋巴细胞转化，提高免疫调节活性[23]。此外Dgn 有保护软骨细胞的作用，可能通过减轻线粒体氧化应激损伤实现[24]。纤细薯蓣皂苷也与保护骨细胞相关，通过下调破骨细胞分化相关基因抑制破骨细胞形成和吸收[25]。

青藤碱（SIN）的抗炎、调节免疫作用主要是降低炎性因子水平和抑制巨噬细胞活化迁移过程。SIN 可以下调多种炎性因子水平，通过阻断活化的TLR4/MyD88/NF- B 信号通路，SIN抑制巨噬细胞迁移及免疫应答，并促进巨噬细胞自噬[26,27]。SIN 抑制TNF-诱导分泌，调节体内TH17/Treg 的失衡，抑制成骨分化从而减轻关节炎、减少骨侵蚀[28]。在镇痛方面，SIN可以改善神经 免疫失衡，抑制氧化应激和慢性疼痛状态的中枢致敏[29]。

3.2 PPI网络核心基因

PPI 网络中的核心基因有ALB、IGF1、ESR1、AR、MMP2 和IL2。血清白蛋白（ALB）有良好的结合转运能力，是维持血浆胶体渗透压的重要成分。ALB在AS患者中是一个有效的评价指标，缺血修饰白蛋白（IMA）、纤维蛋白原与白蛋白比值在AS 患者中明显升高，均与疾病活动相关[30,31]。胰岛素样生长因子1（IGF1）具有高效的促生长活性，在间充质干细胞中起到促进增殖和成骨细胞分化，促进骨形成的作用[32]。此外IGF-I通过阻断PI3K/AKT/TLR4 通路减弱IL-6 和TNF- 分泌，起到抗炎效果[33]。雌激素受体（ESR1）和雄激素受体（AR）等类固醇激素及其受体参与调节靶组织中的细胞增殖和分化。雌二醇可减少破骨细胞生长因子产生，起到保骨作用[34]。AR 能够促进M2 巨噬细胞分化及自噬，从而减轻炎症反应和组织凋亡，促进组织的修复[35]。MMP2 是一种广泛存在的金属蛋白酶，中国人群中MMP-2 rs243865 C/T 基因的多态性可能与AS风险有关[36]。AS 患者中下调MMP-2 表达可使成骨细胞分化和骨形成中的转录因子下调，防止异位骨化中的成骨细胞分化[37]。白细胞介素-2（IL2）是T 细胞增殖的必要生长因子，是人体免疫调节网络的核心物质。AS 患者血清中IL-2 水平显著升高，且与炎症反应标志物、疾病活动指数等指标呈正相关，经治疗后可降低[38]。AS 患者外周血中CD4+Treg 和CD8+Treg 细胞减少，IL-2 处理可纠正Treg/Th17 细胞失衡，发挥免疫调节和抗炎作用[39]。

3.3 KEGG通路

KEGG 通路富集分析显示，青风藤 穿山龙药对治疗AS 的交集基因靶点富集在类固醇激素生物合成、卵巢类固醇生成、补体和凝血级联、foxo信号通路、AMPK 信号通路、PI3K-Akt 信号通路和T 细胞受体信号通路。

类固醇激素包括性激素和皮质激素。在治疗AS中，局部注射糖皮质激素有利于改善关节炎和附着点炎，这得益于其抗炎、抑制免疫功能，但不建议全身糖皮质激素长期应用。雌激素E2 缺乏可使Th17 细胞分化增加，E2 可抑制IL-17 介导的破骨细胞分化，减少骨质流失[40]。E2 还可以降低小鼠中TNF、干扰素-和IL-17A 的表达起到抗炎作用[41]。另一种类固醇激素维生素D，一方面可调节骨组织钙磷吸收，另一方面可参与调节免疫、炎症反应，维生素D 在固有免疫早期可增强细胞募集和细胞因子分泌，并通过负反馈机制防止广泛的炎症和组织破坏；在适应性免疫中促进初始T细胞活化，增强抗原呈递，间接调节DC 功能[42]。较高的血清维生素D 水平是AS 的保护因素，维生素D活化产物25OHD水平与AS患病风险呈负相关[43,44]。

补体和凝血级联通路中，补体系统是固有免疫中的重要介质，补体系统异常则会导致慢性炎症和组织损伤，减少补体激活可以降低AS 中心血管疾病发病率[45]。在AS 中可见补体激活产物沉积，攻击成骨细胞和破骨细胞，使用补体抑制剂能有效阻止免疫细胞的增殖和分化[46]。凝血系统的激活与炎症性疾病的疾病活动有关，axSpA 患者体内纤维蛋白原和D-二聚体升高，且与炎症及疾病活动度呈正相关[47]。

foxo 信号通路中FoxO 转录因子通过控制T、B淋巴细胞的功能和发育，调节免疫稳态和免疫耐受，在FoxO活性失调时导致慢性炎症和自身免疫[48]。Foxo1失活会抑制CD8+T 细胞反应中的aTreg 细胞迁移，过度激活则会导致CD8+T细胞依赖性的炎症疾病[49]。

AMPK信号通路、PI3K-Akt信号通路与骨形成和代谢相关。AMPK 是一种蛋白激酶，在AS 中，它可以激活自噬刺激成骨细胞的分化和矿化及负向调节抑制破骨细胞的分化和功能[50]。PI3K/Akt通路可调节骨髓中的细胞增殖迁移和成骨分化[51]。PI3K-Akt通路被抑制后，影响成骨细胞的早期分化和晚期钙化，破骨细胞形成受抑制[52]。两个通路共同起到促进成骨细胞存活、抑制破骨细胞形成和抑制成纤维细胞转化成骨的作用。

T 细胞受体信号通路是T 淋巴细胞增殖、分化，激活免疫效应的重要组成，在HLA-B27 阳性的AS患者中具有高度同源性TCR 的T 细胞克隆，表明AS相关的T 细胞克隆型的存在和富集参与了发病[53]，当AS 处于高活动度时，病理性CD4+T 细胞可能因为与CD8+共享TCR 而识别HLA-B27 呈递的自身抗原，激活T 细胞不均衡扩增[54]。

4 小结

综上所述，青风藤 穿山龙药对治疗强直性脊柱炎，主要通过化学成分薯蓣皂苷元、纤细薯蓣皂苷与青藤碱，关键靶点基因可能是ALB、IGF1、ESR1、AR、MMP2 和IL2，主要信号通路为类固醇激素生物合成、补体和凝血级联、AMPK 信号通路、PI3K-Akt 信号通路、foxo 信号通路和T 细胞受体信号通路，多靶点、多通路共同起到调节免疫反应、抑制炎症过程和调控骨细胞活性等作用。但由于个别药物化学成分靶点信息较少，各数据库收录、匹配靶点算法不同，药物成分、靶点基因与疾病之间的关系还需要进一步实验验证。