鹿繁殖技术的研究进展

魏倩倩，王岩，许保增，赵伟刚，常忠娟，杨乾龙，范冰峰，薛海龙，罗剑通，杨镒峰，赵蒙※

（1.中国农业科学院特产研究所，吉林 长春 130112；2.中国农业科学院研究生院，北京 100081；3.西丰县鹿业发展局，辽宁 西丰 112400）

近年来，随着科技的进步和社会的发展，越来越多的人投身到养鹿产业中，尽管养鹿规模不断扩大，但集约化生产体系尚未完善。鹿繁殖力低下是制约养鹿业发展的主要瓶颈之一，影响鹿繁殖力低下的因素很多，除对鹿的生殖生理特点缺乏系统地研究之外, 自然环境条件、人工辅助繁殖方法、饲养管理以及其他技术水平都是重要的影响因素, 这些因素通过不同的途径直接或间接地作用于鹿群繁殖过程中的各个环节, 最终调控繁殖力。繁殖力低不仅导致鹿群扩繁速度慢，还延长了新品种的培育周期。通过借助人工授精、超数排卵和胚胎移植等辅助繁殖技术不仅能提高母鹿繁殖能力，还能最大化利用优秀种公鹿的精液，扩大后代鹿群数量，延长种公鹿的使用年限。本文对国内外鹿繁殖技术研究进行系统综述，为提高母鹿繁殖性能，促进养鹿业高效发展提供参考。

1 人工授精

鹿是一种半驯化的野生动物，过去一直采用自然交配的方式配种，在自然交配条件下，1 只优良种公鹿最多配种20 只母鹿，而1 只优良种公鹿可产冷冻精液2 000 多管,如果用于人工授精，1 只母鹿使用2 管精液，可为1 000 只母鹿授精，是本交的50 倍[1]。人工授精技术的应用，对提高优良种公鹿的利用率意义重大，与传统的配种方法相比，人工授精技术的应用在减少种公鹿的饲养数量的同时，还增加了与配母鹿的数量，降低了种公鹿的养殖成本，加速了鹿的遗传改良进程。

精液采集方法是影响人工授精的重要因素，主要有假阴道法、附睾取精法和电刺激法。目前，安全收集精液并广泛被接受的方法是在全身麻醉下使用电刺激法，虽然使用麻醉药对动物有危害，但相较于自然交配精液收集的方法，它适用于所有个体而不是少数经过特别训练的动物，并且耗时短、操作便利。精液冷冻保存技术是伴随人工授精技术发展起来的新型辅助繁殖技术，是人工授精技术的关键环节，有效解决了精液长期保存的问题[2]。精液冷冻包括颗粒冷冻、安瓶冷冻和细管冷冻等，目前，鹿精液冷冻多采用细管冷冻，细管冻精使精液在冻存的过程中不受细菌污染，而且冷冻后精子的活力和顶体的完整率基本不受影响。此外，人工授精技术中除了技术人员的操作手法以及熟练程度外，选择适合的精液稀释液对受胎率也有极大的影响，在以卵黄为基础的稀释液研究中，Haigh 等[3]在精液中通过加入卵黄和甘油作为冷冻保护剂，使精子降温和冷冻过程中其稳定性不受损害且复苏后精子的活力不受影响。Zhang 等[4]研究表明，含有1.0% 蛋黄的冷却剂可以较好地用于驴精液的冷却保存，添加小蛋黄颗粒的冷却剂也可以达到一定的效果，但Ferrante 等[5]说在冷却剂中添加卵黄对膜功能和顶体状态有一定的危害。而Stewart 等[6]撤去卵黄精液稀释液在白尾鹿上取得成功，但收集和冷冻精液的最佳时间仍不确定。近年来，冷冻精液相关研究主要集中在冷冻保护剂和稀释液配方的筛选、冷冻程序优化和解冻液等环节，对精液冷冻保存进行了深入的研究[7-9]，随着冷冻方法和冷冻保护剂的不断改良，精子存活率有了较大的提高，该技术对于精子的授精能力也有一定的影响[10]。

用冷冻精液进行人工授精可以选择和传播优良基因，但人们对整个发情期进行精液冷冻保存的最佳时间知之甚少[11]。Stewart 等[12]在繁殖季节早期（9 月，n=6）、发情高峰期（12 月，n=8）和繁殖季节后期（3 月，n=7）采集白尾鹿精液，比较不同时期冷冻保存后精液质量，研究结果表明精子整体活力、质膜完整比例在发情高峰期最高。马鹿在发情高峰期的高质量精液被归因于增加的抗氧化产物，这可以保护精子免受氧化应激[13]，低温保存后氧化应激与马鹿低温保存后染色质损伤增加和顶体完整性丧失有关[14]，并已被证明对多种物种的生育能力产生不利影响。

除此之外，输精技术是造成人工授精技术成功效率低下的另一个重要因素[15]，Oliveira等[16]、杨莉等[17]进行了输精部位对驴受胎率的影响的研究，发现子宫角深部输精的受胎率均比子宫体内输精显著提高。目前，马鹿应用最广泛的是直肠把握法，梅花鹿常用开膣器或腹腔镜输精法在子宫颈阴道开口完成输精[18]。而子宫内输精和子宫角深部输精技术结合精液冷冻保存技术还需深入研究。

2 同期发情

目前，国内对鹿的同期发情使用较多的为CIDR+PMSG法。2005 2006 年蔡志刚等[19]在繁殖季节前期对50只马鹿用CIDR+PMSG 法进行同期发情处理，结果表明，同期发情率分别为84.3%，88.5%。杨艳[20]在繁殖季节采用孕酮阴道海绵栓（CIDR）+孕马血清促性腺素（PMSG)法对1 035 只塔里木马鹿进行同期发情处理，取栓后注射400~500 IU PMSG，其中有921 只发情，同期发情率为89%，定时输精受胎率为44%。高庆华等[21]对140 只天山马鹿采用CIDR+PMSG+PG 方法进行同期发情处理，同期发情率达85%，情期受胎率达50%。魏海军等[22]将梅花鹿分成2组，采用CIDR ＋PMSG 法进行同期发情处理，1 组注射200 IU，2 组注射150 IU，两组的同期发情率分别为86%（18/21）和92%（22/24），对发情母鹿进行腹腔镜人工输精，两组母鹿产仔率分别为50%和38%。向振博等[23]用CIDR+PMSG对梅花鹿进行同期发情试验，受胎率为71.8%。

3 胚胎移植

胚胎移植技术最早应用于牛的繁育，鹿的胚胎移植发展较慢，公开报道显示鹿的胚胎移植的首次应用是由Waldhalm 等[24]完成。随着胚胎移植技术的不断发展，在黇鹿、赤鹿、马鹿和麋鹿等进行胚胎移植并取得了成功[25,26]，我国也陆续开始了鹿胚胎移植技术方面的研究，李树静等[27]在马鹿的胚胎移植中用自然发情的马鹿进行鲜胚移植并成功产下2 个后代。高庆华等[28]将天山马鹿超数排卵得到的胚胎移植给13 只受体，其中7 只马鹿受胎。王梁等[29]通过对胚胎移植技术的不断改进和完善，建立了梅花鹿胚胎移植技术体系，并首次成功应用胚胎玻璃化冷冻技术，这一技术的改进将有利于梅花鹿胚胎移植的发展。赵列平等[30]以不同处理方式对马鹿移植效果进行比较，其中同期发情鲜胚移植成功率52.8%，自然发情鲜胚移植成功率72.2%，同期发情冻胚移植成功率40.0%，自然发情冻胚移植成功率42.9%。研究结果表明，马鹿胚胎移植比自然发情鲜胚移植效果好。中国农业科学院特产研究所对梅花鹿进行鲜胚移植，获得3 只胚胎后代，这是我国首次获得梅花鹿胚胎移植后代[31]。

4 胚胎冷冻

胚胎冷冻不仅是保存、传递遗传信息行之有效的的方法，也是人工授精、胚胎移植和转基因等技术密不可分的一部分。鹿胚胎冷冻技术发展经历了从慢速冷冻到玻璃化冷冻过程。Dixon 等[32]以甘油作主要冷冻保护剂，首次用慢速冷冻法对马鹿胚胎进行冷冻，但慢速冷冻需要高精密的自动控温设备和长时间的平衡冷却过程，操作步骤较为复杂，因此在某些实验过程中会受到一定的限制，这种相对耗时的技术已被其他技术所取代，而后就出现不需要经稀释和冷冻仪器的乙二醇慢速冷冻法和玻璃化冷冻法。Soler 等[33]在马鹿胚胎冷冻试验中，OPS 法冷冻、解冻胚胎和细管法玻璃化冷冻，解冻后胚胎移植的妊娠率分别为53.3%和70.0%，可见，在马鹿胚胎冷冻保存过程中，玻璃化冷冻方法具有显著优势。王梁等[29]在梅花鹿上应用胚胎玻璃化冷冻技术成功获得受体妊娠率为61.54%，产仔率为53.85%，与鲜胚移植的妊娠率和产仔率没有显著性差异。玻璃化冷冻法能够避免细胞内冰晶形成，使得样品在冷冻保护溶液中形成玻璃化。玻璃化冷冻技术因其简便、快速、低成本以及更好地保护胚胎避免受到冷冻带来的细胞损伤而被人采用[34]。

5 性别控制

在自然繁殖情况下，鹿繁殖得到雌雄鹿的概率相同，而雄鹿的经济价值远高于雌鹿，如果能对后代的性别进行干预，就能扩大雄鹿数量，从而提高产茸量。使用性别控制技术加速繁殖优良公鹿，解决制约养鹿业发展的瓶颈问题——优良种公鹿缺乏，推动我国养鹿业发展具有重要现实意义。目前，性别控制可以通过精子分离或早期胚胎性别鉴别来实现，在实践应用中PCR 早期胚胎鉴定还有诸多弊端，利用流式细胞术对具有X 染色体和Y 染色体的精子进行性别分选是确定后代性别最实用和有效的方法[35]，该技术已成功应用于梅花鹿和马鹿以产生所需性别的后代[36]。赵列平等[37]对469 只马鹿、79 只梅花鹿进行分离Y 精子性别控制研究，X、Y 精子的性别准确率达90%以上。董云祥等[38]对马鹿性控冻精人工授精试验，经过3 年的研究实现了总受胎率为95%，性控准确率为100%。目前我国已经建立了茸鹿精子性控冷冻精液生产技术流程，并收集了国内5 个优秀的种马鹿细胞系。

6 妊娠诊断

最早使用的早期妊娠诊断方法是外部观察法，但此种方法不十分准确，随后应用直肠检查方法，虽然直肠检查已成为一项重要而常规的繁殖技术，但该方法需要准确把握发情周期中卵巢上黄体、卵泡及子宫中胎膜发育早期的精细变化，操作繁琐，技术要求较高，操作不当易造成胚胎损失等。此外，妊娠诊断还有血液黄体酮测定技术、粪便中类固醇激素代谢物测定技术和PSPB 技术[39]，刁晓平等[40]在对海南坡鹿生殖状况与粪便中孕酮含量研究的试验中，测定3 只坡鹿粪便中孕酮含量，结果表明怀孕后孕酮含量明显上升，分娩后孕酮含量迅速降至低浓度水平，通过分析粪便中孕酮含量变化反映坡鹿的生理状况并作为早期胚胎诊断的依据。国外资料记载对圈养的驼鹿利用粪中孕酮含量和盲区检查，其中26 只怀孕鹿中诊断出22 只，诊断准确率为84.62%，而利用粪便中雌二醇含量诊断准确率为57.7%。这种方法虽然准确灵敏，但操作繁琐不宜在现场进行。B 超是继直肠触诊和激素测定之后在鹿生殖领域最有深远意义的诊断技术，B 超诊断为在活体状态下研究鹿的生殖和生理机能提供了一个便利的窗口。王梁等[41]采用超声波技术对14 只鲜胚移植和13 只冻胚移植的梅花鹿进行妊娠诊断，妊娠诊断率分别为85.71%和61.54%。

7 克隆

绵羊Dolly 是世界克隆的第1 个哺乳动物，它的诞生为克隆技术在其他哺乳动物的应用奠定了基础，而后克隆出鼠、牛、山羊、猪和猴等动物，鹿的克隆技术在国外也有报道。2003 年美国克隆出名叫“杜威”的白尾鹿，这是首次成功克隆鹿科动物。Berg等[42]利用84只马鹿的鹿茸干细胞及其分化的细胞成功克隆了8 只马鹿，克隆率为10%，并且后代的遗传物质基本与供体一致。随着克隆技术的不断发展，我国也开始尝试鹿的克隆技术，2009 年内蒙古大学与赤峰健元鹿业和蒙牛繁育生物技术有限公司合作，成功克隆出3 只马鹿。利用同种动物体细胞核移植技术发展至今已经比较成熟。徐静等[43]突破传统克隆的束缚开始了对梅花鹿同种和梅花鹿-牛异种克隆进行探索，分别获得同种核移植重组胚胎54枚，梅花鹿-牛异种核移植重组胚胎49枚，同种重组胚4 枚，融合率分别为44%、32.65%和75%，将获得的重组胚胎移植给经同期发情处理的梅花鹿，受体均无受胎。作者认为失败的原因可能与受体的免疫系统对移入的胚胎发生排斥所致，因此要进一步探索减少或消除受体排斥的方法，从而提高异种胚胎妊娠率。鹿克隆技术的意义深远，但其应用研究进展相对缓慢，相关技术仍很不完善，基础理论研究也相对薄弱，对一些早期胚胎发生和发育机制缺乏深入了解。

8 结语和展望

通过利用鹿的繁殖技术虽然培育了一些优良种公鹿，但鹿的繁殖技术与其他动物相比发展仍较落后。目前，鹿的人工授精、同期发情技术和性别控制技术已经趋于成熟，但鹿的胚胎移植、胚胎冷冻后的妊娠率仍较低，我们还应借鉴家畜的一些相关成果继续深入研究，根据鹿的生殖生理特性找到优秀种群的扩繁技术和新品种的选育方式，促使茸鹿产业给人类带来最大化的利益。