基于UPLC-Q-Exactive-MS 代谢组学技术的清肺化痰颗粒对发热大鼠的调控作用研究

张洪铭，郭文军，孙英莲，王英军，解生旭，徐雅娟※

（1.长春中医药大学，吉林 长春 130117；2.吉林省中医药科学院第一临床医院中药药效物质基础重点实验室，吉林 长春 130012）

发热是较多疾病的共同特征，具有复杂的病理过程，现代医学认为发热是因外源性热原作用于免疫活性细胞导致机体产生内源性热原，而内源性热原作用于环磷腺苷等体温调节介质导致机体产热增加或散热减少[1,2]。清肺化痰颗粒（QFHT）是吉林省中医药科学院第一临床医院的协定方剂，由桑白皮和地骨皮等12味药材组成，在解热、祛痰、镇咳和平喘的临床应用中疗效确切，但该方剂的药效物质基础和作用机制尚未明确，需要利用全面有效的研究手段进行探讨。近几年提出的代谢组学研究思维符合中药多成分、多靶点和多途径的系统性治疗原则，该研究方法已被广泛应用于探讨药物作用机制[3-5]。本文拟以UPLC-Q-Exactive-MS的血清代谢组学为技术手段，筛选酵母诱导大鼠发热的潜在生物标志物，探讨QFHT解热作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF 级SD 大鼠60 只，雌雄各半，180~200 g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证号：SCXK（辽）2020-0001；质量合格证号：210726210100264952，实验动物使用符合伦理委员会规定。

1.2 试药与试剂

QFHT由吉林省中医药科学院第一临床医院制剂室提供；对乙酰氨基酚片，葵花药业集团湖北武当有限公司，批号：190402；酵母浸粉，北京奥博星生物技术有限责任公司，批号：20120516；氯化钠注射液，长春豪邦药业有限公司，批号：S13030601；质谱级甲醇，德国Fisher 公司；超纯水（Milli-Q 仪器所制）；大鼠环磷酸腺苷（cAMP）酶联免疫分析试剂盒，上海酶联生物科技有限公司，批号：03/2021。

1.3 仪器

ST-360酶标仪，上海科华实验系统有限公司；Vanquish Duo 超高效液相色谱仪，Q-Exactive 质谱仪，美国Thermo Fisher Science；GL-21M 高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；PD-1C-80 冷冻干燥机，上海比朗仪器制造有限公司。

1.4 方法

1.4.1 动物分组及给药 实验前每只大鼠测肛温2次，选取体温波动不超过0.5℃的大鼠为实验用大鼠，以2次合格体温的平均值作为大鼠基础体温值。大鼠60 只，兼顾体温、体重将其均分6 组，每组10 只，分别为对照组、模型组、阳性药组、QFHT 高剂量组、中剂量组和低剂量组。阳性药组灌胃0.1 g/kg 对乙酰氨基酚片，给药组灌胃3.5 g/kg QFHT，对照组给予同体积水，连续给药5 d，末次给药前大鼠禁食不禁水16 h，末次给药后，除对照组外，其余各组大鼠立即于背部皮下注射15%酵母混悬液10mL/kg 致热，建立大鼠发热模型。

1.4.2 药效学评价 各组大鼠致热后1 h、2 h、4 h、5 h和6 h 各测肛温1 次，记录体温值并计算与基础体温差值；大鼠最后1 次测量体温后腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g），腹主动脉采血，静置3 h，3 000 r/min离心10 min 分离血清，按照cAMP 酶联免疫法测定大鼠血清cAMP 的含量。

1.4.3 血清代谢组学分析

1.4.3.2 液相质谱条件 色谱柱：Hypersil GOLD（50 mm 2.1 mm，1.9m）；流动相：水（A）-甲醇（B），梯度：5% B（0~2 min），5%~35% B（2~5 min），35%~55%B（5~12 min），55%~65%B（12~14 min），65%~100%B（14~20 min），100% B（20~25 min），100%~5%B（25~30 min），5%B（30~35 min）；流速0.4 mL/min；进样量：5L；柱温：50 ℃。

采用电喷雾电离源（ESI），样品分别采用正、负离子模式检测。鞘气流量60 Arb；辅助气流量15 Arb；毛细管温度300℃；一级检测扫描范围100~1 500 m/z，分辨率35 000。二级裂解扫描范围100~1 500 m/z，分辨率17500，裂解能量为10，20，30；动态排除设为30s。

1.4.4 主成分分析和潜在生物标志物的筛选 使用Compound Discoverer-3.1 对原始的UPLC-Q-Exactive-MS 数据进行预处理，得到包含每个离子峰的保留时间、m/z值和归一化强度等详细信息的多维数据集，保存为.csv 文件并导入SIMCA-P14.1 软件，建立偏最小二乘判别分析（PLS-DA）模型，探讨不同组间血清代谢物的差异，参数R2Y 和Q2被用来评价PLS-DA 模型的拟合程度。模型组与对照组比较，根据投影值（VIP＞1）和P ＜0.05，筛选潜在生物标志物。分析给药组与模型组之间这些潜在生物标志物的水平来说明QFHT对大鼠解热的作用。

1.4.5 潜在生物标志物的鉴定及通路富集分析 潜在生物标志物的一级和二级质谱碎片信息与人类代谢组数据库（HMDB，http://www.hmdb.ca） 中已知代谢物的碎片信息进行比对，来实现潜在生物标志物的鉴定。将鉴定出的潜在生物标志物导入MetaboAnalyst 5.0 网站进行通路富集分析。

2 结果

2.1 QFHT 对发热大鼠体温和血清中cAMP 的影响

如图1 A 所示，与对照组相比，模型组大鼠在注射酵母混悬液后体温逐渐增加，4 h 后体温显著升高，且大鼠出现活动减少、足部、耳廓和鼠尾发红发烫的现象，表明发热模型建立成功。与模型组相比，阳性药组和QFHT 中剂量组大鼠体温均呈现下降趋势，且效果明显（P ＜0.05）。如图1B 所示，造模6 h 后，模型组大鼠血清中cAMP 含量明显高于对照组，阳性药组和QFHT 中剂量组大鼠血清中cAMP 含量明显低于模型组（P ＜0.05），结果表明QFHT 具有解热作用。

图1 各组大鼠肛温上升曲线图（A）和血清中cAMP 含量柱形图（B）Fig.1 Curve of anal temperature rise (A)and column chart of serum cAMP content (B)of rats in the each group

2.2 血清代谢轮廓分析

利用UPLC-Q-Exactive-MS 分析对照组、模型组、阳性药组和QFHT 中剂量组大鼠的代谢轮廓，进样分析每10 个血清样品后，进样一次QC 样品，分析评价仪器和方法的稳定性。QC 样品的原始数据进行预处理后，在正离子模式（P）和负离子模式（N）下提取了包含4 755 个和2 331 个离子的两个数据集，通过计算同一离子在不同QC 中归一化强度的相对标准偏差（RSD%）来评价仪器和方法的稳定性。如图2 所示，在正离子模式和负离子模式下分别有74%和70%的被测离子的相对标准偏差小于30%[6]，表明该方法重复性、稳定性良好。

图2 所有代谢物在QC 样品中的RSD（%）分布Fig.2 RSD(%)distribution of all metabolites in QC samples

血清样品总离子流图如图3 所示，各组间总离子流图存在细微差别，但直观分析不足以阐明各组间血清代谢谱的差异，故采用主成分分析的手段进一步阐明QFHT 对发热大鼠代谢谱的影响。

图3 总离子流图Fig.3 Total ion flow diagram

将对照组、模型组和QFHT 中剂量组的多维数据集导入SIMCA-P 14.1 建立PLS-DA模型，并进行200次置换检验对模型进行验证，具体拟合参数见表1，一般认为R2Y 及Q2值大于0.5 的模型拟合较好，稳定性较高[7]。如图4A、4B 所示，模型组和对照组主成分间完全分离，表明大鼠经干酵母造模后，血清代谢谱发生紊乱，发热模型造模成功。图4C、4D 中显示，QFHT中剂量组的聚类脱离了模型组，而表现出接近对照组的趋势，表明QFHT中剂量组的大鼠发热已得到恢复，QFHT 起到了解热的效果。

图4 PLS-DA 得分图Fig.4 PLS-DA score diagram

表1 置换检验的拟合参数Table 1 Fitting parameters of the replacement test

2.3 潜在生物标志物筛选及鉴定

分析模型组和对照组的PLS-DA 得分图，根据投影值（VIP ＞1）和t 检验（P ＜0.05）筛选了123 个潜在生物标志物，将潜在生物标志物的碎片信息与HMDB数据库进行比对鉴定。以RT 18.876 min-m/z 480.309 6的LysoPE（18:0/0:0）离子为例说明了鉴定结构过程，如图5所示，在m/z 196.037 5处观察到对应于C5H11NO5P-头基的碎片离子，并且在m/z283.2643 处观察到该头基碎片的损失；m/z 214.048 6、m/z 140.011 8 和m/z 78.959 1 处的离子分别代表头基上的C5H13NO6P-、C2H7NO4P-和O3P-碎片离子，以此将RT18.876min-m/z480.309 6离子鉴定为LysoPE（18:0/0:0）。

图5 LysoPE（18:0/0:0）二级质谱图Fig.5 LysoPE(18:0/0:0)secondary mass spectrometry

通过上述方法鉴定出21 个潜在生物标志物，并运用MetaboAnalyst 5.0 分析了潜在生物标志物在各组间的变化趋势，大鼠发热后21 个潜在生物标志物发生不同程度的改变，并在QFHT治疗后能够被逆转，详细信息见表2，表明QFHT 可以通过调节这些潜在生物标志物达到解热的效果。

表2 内源性潜在生物标志物及其在组间的变化趋势Table 2 Endogenous potential biomarkers and their variation trends among groups

这些潜在生物标志物的改变提示了代谢表型发生变化，有助于了解大鼠发热的潜在代谢机制和QFHT的治疗机制。生成热图以显示不同组中每个生物标记物的相应水平。如图6 所示，不同组间的色差表现出潜在生物标志物的变化。

图6 潜在生物标志物热图Fig.6 Heat map of potential biomarkers

2.4 代谢通路分析

将潜在生物标志物的Compound Name导入MetaboAnalyst 5.0 进行通路富集分析，共富集9 条代谢通路，见图7，其中Impact ＞0.1 为最主要的代谢途径，详见表3，表明QFHT解热的机制与调控色氨酸代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢有关。

图7 潜在生物标志物的代谢通路分析Fig.7 Metabolic pathway analysis of potential biomarkers

表3 潜在生物标志物的代谢通路参数Table 3 Metabolic pathway parameters of potential biomarkers

3 讨论

发热是较多疾病的共同临床特征，具有复杂的病理过程。现代医学认为，细菌、病毒、真菌和炎性渗出物等外源性热原作用于免疫活性细胞，导致机体产生内源性热原[1]。内源性热原最初作用于前列腺素、环磷腺苷等体温调节介质，通过它们的正向调节，使得大脑中的体温调节点上移，导致产热增加或散热减少，最终引起发烧[2]。常用于诱导大鼠发热模型的诱导剂为干酵母、脂多糖和2，4-二硝基苯酚、面包酵母和酿酒酵母甘露聚糖等[8]，其中2，4-二硝基苯酚性发热模型升温最快，但持续时间较短；脂多糖诱导的发热模型的特征为双相或三相发热，其造模剂量极小，高剂量易导致动物死亡；与前两个诱导剂诱导的发热模型相比，干酵母诱导的发热模型相对稳定，热程长，重复性好，且原料易得[9]。

发热反应大多是各种致热因子作用于机体，产生和释放内热原，并进一步影响体温调节中枢，使调温起步点提高，体温相应升高。大鼠皮下注射酵母悬液可激活产生内热原。内生致热原一般包括IL-1、IL-6和TNF-等，体温中枢调节介质包括单胺物质、cAMP和PGE2等，发热过程中，内生致热原通过中枢发热介质作用于体温调节中枢，使体温调定点上移，机体产热。本实验通过皮下注射15%酵母混悬液建立感染性发热大鼠模型，结果QFHT 给药组在给药后4 h 对酵母引起的大鼠体温升高具有降低作用。

cAMP 是中枢神经系统重要的炎症介质之一，是体内第二信使，对外界刺激做出反应的一类重要的信息传递分子，也是中枢主要的正性发热介质，cAMP含量上升是多种致热原引起发热的共同中间环节[10]，可以通过内源性热原 下丘脑Na+/Ca2+-cAMP 途径参与体温调节[11-13]。因此抑制cAMP 的合成和释放是抑制发热反应的有效方法。本实验运用ELISA法测定大鼠血清中cAMP 含量，结果表明，对乙酰氨基酚组和QFHT 给药组可明显降低发热大鼠血清中cAMP 的含量（P ＜0.05）。提示QFHT 具有一定的解热作用，其解热机制可能是通过调节中枢发热介质cAMP，从而达到降低体温的作用。

色氨酸是人体必需氨基酸，主要参与蛋白质合成和代谢网络的调节，其中5-羟色氨酸是5-羟色胺（5-HT）的前体物质，5-HT途径是色氨酸降解的主要代谢途径之一。据报道，酵母菌引起的发热与5-HT 有关，而下丘脑5-HT含量与温度呈正相关[14]。有研究表明，5-HT等中枢神经系统单胺类神经递质能引起大鼠发热[15]。本实验中，与对照组相比，高热大鼠体内色氨酸、5-HT显著升高，提示色氨酸合成5-羟色胺的能力增强，从而导致体温升高，给予QFHT 后，色氨酸、5-HT 水平明显下降，表明下丘脑体温调节中枢受到调节，从而达到解热作用，同时也证实了QFHT 调控色氨酸代谢的可能。

有研究发现，脑室注射IL-1 脑脊液中牛磺酸显著增多，同时一些动物实验表明，牛磺酸能够缓解发热过程中出现的兴奋冲动传递和电解质的改变等。家兔脑室内注射牛磺酸，能够抑制由内毒素、致热性细胞因子或PGE2 诱发的发热反应[16]。牛磺熊去氧胆酸是熊去氧胆酸和牛磺酸结合的产物，本代谢组学实验中，模型组牛磺熊去氧胆酸显著改变，QFHT治疗后，其水平发生逆转，提示QFHT 通过调控牛磺酸和亚牛磺酸代谢途径起到解热的疗效。

本研究通过UPLC-Q-Exactive-MS 代谢组学技术发现QFHT 对发热大鼠的治疗作用与其改善血清中内源性潜在生物标志物的水平有关，并主要通过调控色氨酸代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢途径发挥解热作用，可为临床上QFHT 的合理应用提供理论依据。