植物油中不饱和醛作为特征氧化指标的适用性

马路凯，崔 芸，刘 漩，刘袆帆，陈海光，程威威，李琳琳，刘国琴，朱立学

（1 仲恺农业工程学院轻工食品学院 广州 510225 2 仲恺农业工程学院现代农业创新研究院 广州 510225 3 深圳大学高等研究院 广东深圳 518000 4 华南理工大学食品科学与工程学院 广州 510225）

油脂是食物的组成成分，不仅为机体提供能量，还可提供多种必需脂肪酸和脂溶性营养素[1]，具有预防心脑血管等慢性疾病，促进大脑发育等重要的生理作用[2]。只有保证油脂安全，才能更好地发挥其营养功效。植物油在精炼、加工、消费及贮藏过程中，会产生一些对人体健康有危害作用的物质，如反式脂肪酸（TFA）[3]、丙烯酰胺（AA）[4]、苯并（a）芘[5]、缩水甘油脂肪酸酯（GEs）[6]等，这些危害物多产生在植物油的加工过程，关于其生成规律目前有较为系统的研究，且已形成有效的抑制方法[7]。

植物油在贮藏过程中会发生自动氧化，尤其是富含多不饱和脂肪酸（PUFA）的植物油，生成较多的氧化产物，以醛类物质为主。在生成的众多醛类物质中，一些醛较难挥发，具有多种活性基团，有极强的反应活性，可与蛋白质、DNA、磷脂等多种生物大分子发生共价结合，破坏其原有结构和功能，具有一定的细胞毒性。其中丙二醛（MDA）、4-羟基己烯醛（HHE）和4-羟基壬烯醛（HNE）是3种典型的非挥发性活性醛。Butterfield 等[8]研究发现HNE 与载脂蛋白上的Cys 残基结合，增加患阿尔茨海默病的风险。有研究[9]还发现HNE 的过度表达与前列腺癌的分级相关。Guillén 等[10]在多种植物油和油炸食物中发现了MDA、HNE 和HHE。比利时Papastergiadis 等[11]对16 种食物中3 种醛的分布进行研究，发现MDA、HHE 和HNE 的检出率分别为84%，16%和63%，其中热加工植物油和油炸食物中3 种醛的含量较高。其广泛的分布及较高的含量，在国际上引起广泛关注。比利时高级卫生委员会 （Belgian Superior Health Council）认定MDA 和HNE 是危害人类健康的主要问题之一[12]。美国学者指出HNE 可能是一种引发公共健康问题的风险因子[13]。欧洲食品安全局（EFSA）科学委员会设定MDA、HNE 和HHE 的毒理学关注阈（TTC）值，分别为30，1.5 μg/（kg bw·d）和1.5 μg/（kg bw·d）[11]。至此，关于MDA，HHE 和HNE的研究成为新一轮的热点。国内关于其在植物油贮藏过程中的生成以及作为植物油氧化指标，目前尚未见报道。

本研究选取5 种市售植物油，研究其在储藏过程中3 种毒性醛类物质MDA、HNE 和HHE 的生成规律，同时探究其作为特征性油脂氧化指标的适用性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

棕榈油（PO）、玉米油（CO）、菜籽油（RO）、茶籽油（CLO）和亚麻籽油（LO），广州沃尔玛超市；95%乙醇（分析纯级）、石油醚（沸程30～60 ℃）、冰醋酸、异辛烷，天津市大茂化学试剂厂；对甲氧基苯胺（分析纯级），上海Aladdin 试剂公司；2，4-二硝基苯肼 （DNPH，分析纯级）、生育酚标品（HPLC），美国Sigma 公司；甲醇（HPLC）、乙腈（HPLC），德国Merck 公司；HHE、HNE（标准品，>98%），美国Cayman 公司。

1.2 仪器与设备

FA3204B 电子天平，上海精科天美科学仪器有限公司；UV-1780 紫外分光光光度计，岛津（上海）实验器材有限公司；GC6890N-5975MS 气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent 公司；P680 液相色谱仪、PDA-100 二极管阵列检测器，美国Dionex公司。

1.3 试验方法

1.3.1 植物油中酸价（AV）、过氧化值（POV）和p-茴香胺值（p-AV）的测定 酸价、过氧化值和p-茴香胺值的测定分别参照国标GB 5009.229-2016《食品安全国家标准 食品中酸价的测定》、GB 5009.227-2016 《食品安全国家标准 食品中过氧化值的测定》 和GB/T 24304-2009 《动植物油脂茴香胺值的测定》。

1.3.2 植物油中共轭二烯值（CDV）的测定 参照参考文献[14]的方法并稍作修改。称取适量油样（0.05～0.20 g）于小烧杯中，用异辛烷溶解并用50 mL 容量瓶定容，于波长232 nm 处测定其吸光度。以异辛烷溶剂做空白。共轭二烯值计算公式：

1.3.3 植物油中脂肪酸组成的测定 脂肪酸组成的测定参考文献[1]方法。样品经甲酯化后，过0.22 μm 微孔滤膜，用气相色谱-质谱联用仪测定（GC-MS）。测定条件：采用Agilent DB-23 色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气为氦气；流速为1.0 mL/min；色谱升温程序：130 ℃保持1 min，5 ℃/min 升温至220 ℃，保持5 min；检测器、进样口温度220 ℃；分流比5∶1；进样量0.2 μL；质谱条件：四级杆温度和离子源温度：200 ℃；扫描范围：33～500（m/z）。

1.3.4 植物油中生育酚的测定 生育酚含量的测定采用GB/T 26635-2011《动植物油脂 生育酚及生育三烯酚含量测定 高效液相色谱法》的方法。

1.3.5 植物油MDA、HNE 和HHE 含量的测定MDA、HHE 和HNE 的测定参考前期建立方法[15]。经DNPH 衍生，所得衍生物用乙醇和水的混合物（1∶1，V/V） 提取。用配有光电二极管阵列检测器（DAD）的高效液相进行分离和检测。条件：流速1.0 mL/min，进样量10 μL。流动相为乙腈和水，梯度洗脱条件：前18 min 为45%溶剂A，5 min 内从45%溶剂A 线性梯度至70%，然后，在70%溶剂梯度洗脱15 min。MDA-DNPH 的测定波长为310 nm，HHE-DNPH 和HNE-DNPH 的测定波长为378 nm。

1.4 数据统计及分析

所有试验重复3 次，取平均值。用软件SPSS Statistics 24.0 进行差异显著性分析 （P<0.05），采用Origin 2016 作图。

2 结果与分析

2.1 不同植物油在储藏过程中MDA、HNE 和HHE的含量变化

不同植物油储藏过程中MDA、HNE 和HHE的生成情况如图1所示。在新鲜市售植物油中有少量3 种醛类物质，且MDA、HNE 和HHE 的含量随贮藏时间的延长而增加。不同植物油中3 种醛的生成情况不同。

5 种植物油中均有毒性醛MDA 生成。图1a、1b、1d所示，储藏期间棕榈油（PO）、玉米油（CO）、茶油 （CLO） 中MDA 的生成量都较少，菜籽油（RO）中MDA 含量变化较大，亚麻油（LO）储藏期间的含量变化最大，且含量最高。Viau 等[16]研究发现，在37 ℃自动氧化过程中，MDA 是ω-3 油氧化产生的主要次级产物。RO、LO 中含有较多的亚麻酸[17]，其结构不稳定，容易发生氧化裂解[18]，生成较多的MDA。PO、CO、CLO 中亚麻酸含量极低，生成较少的MDA。

图1 不同植物油储藏过程中MDA、HNE 和HHE 的生成情况Fig.1 Formation of MDA，HHE and HNE in different vegetable oils during storage

不同植物油储藏过程中生成的HNE 含量差异较大。在新鲜的PO 中没有检测到HNE，而经60 ℃储藏后生成HNE，其含量随时间的延长而增加。PO 与CLO 中HNE 的生成量较少，而CO、RO和LO 中生成较多的HNE，其中CO 生成的HNE最多，RO 和LO 次之。有研究[19]表明HNE 的形成主要与亚油酸的氧化有关。HNE 的生成量差异可能是由脂肪酸种类及含量引起的。

5 种植物油中只有RO 和LO 中有HHE 生成。其中，LO 中HHE 含量随时间的增加迅速增长，RO 中HHE 的含量变化较小。CO、PO 和CLO中没有检测到HHE，可能是这3 种植物油中含有极低的HHE 形成前体物质，或者还含有抑制HHE 形成的物质。文献[20]显示HHE 是由ω-3 脂肪酸的过氧化作用产生的六碳脂醛。也有研究发现[21]HHE 的生成是个累积的过程。HHE 可能作为一些植物油（如RO 和LO）的特征性醛。

MDA、HNE 与HHE 生成量不同的原因可能是不同植物油的脂肪酸组成或其含有抑制醛生成物（如生育酚）。为此，测定了5 种植物油储藏过程中的脂肪酸和生育酚含量变化。

2.2 储藏过程中植物油中生育酚含量及不饱和脂肪酸的变化

为了探究生育酚与MDA、HNE、HHE 生成的关系，检测植物油60 ℃储藏过程中生育酚含量的变化，结果如图2a所示。随着储藏时间的增加，植物油中总生育酚含量呈下降趋势。储藏15 d，仅CO 中检出生育酚。储藏30 d，所有受试植物油中生育酚含量均低于检测限，表明生育酚对油脂氧化的抑制作用有限。有研究[22]发现花生油、茶籽油、玉米油在180 ℃煎炸下，其生育酚含量有下降趋势。Song 等[23]发现植物油在氧化过程中，生育酚含量持续下降直至为零。这是因为天然抗氧化剂中活性成分含量少，且稳定性较差，容易受光、热等因素的影响[24]。

不饱和脂肪酸含量变化如图2b所示。不同植物油中不饱和脂肪酸含量呈显著下降趋势（P<0.05），表明整个储藏期间不饱和脂肪酸发生氧化降解。这说明MDA、HNE 和HHE 的生成与不饱和脂肪酸组成有关。因为总脂肪酸含量随着油储藏时间的延长呈下降趋势，其中饱和脂肪酸所占比例呈增加趋势，不饱和脂肪酸所占比例呈下降趋势[25]。作者之前的研究[26]也发现，在180 ℃条件下8种植物油中HNE 在富含ω-6 脂肪酸的油中含量较高，HHE 在富含ω-3 脂肪酸的油中占主导地位。

图2 不同植物油储藏过程中总生育酚（a）、不饱和脂肪酸（b）含量的变化情况Fig.2 Changes of total tocopherol （a） unsaturated fatty acid （b） content in different vegetable oils during storage

2.3 植物油储藏过程中传统氧化指标的变化

为更好地了解植物油储藏过程中品质变化，测定了30 d 储藏（60 ℃）过程中传统氧化指标酸价、过氧化值、茴香胺值及共轭二烯值的变化，如图3所示。5 种植物油中AV、POV、p-AV、CDV 的含量随储藏时间的延长均显著升高 （P<0.05），表明植物油储藏过程中氧化劣变程度加深，游离酸、过氧化物、醛酮等物质含量增加。

图3 不同植物油储藏过程中酸价、过氧化值、茴香胺值、共轭二烯值的变化规律Fig.3 Changes of acid value，peroxide value，anisidine value and conjugated diene value of different vegetable oils during storage

赵宇明等[27]在研究贮藏对油脂理化指标的影响时发现酸价作为评价油脂氧化的指标不灵敏。Damerau 等[28]研究发现采用单一的传统氧化指标POV、p-AV 在评价油脂氧化稳定性程度时，专一性不强，具有一定的局限性。有研究[14]表明5 种植物油（大豆油、玉米油、菜籽油、葵花籽油、椰子油）中CDV 值和p-AV 值出现不同的变化规律，很难把握二者的结合点，造成评价指标的不准确。单一从POV、p-AV、CDV 的变化来评价油脂氧化程度具有一定的缺陷。

2.4 主成分分析

基于以上数据，为进一步研究植物油中MDA、HHE 和HNE 的形成与不饱和脂肪酸组成的关系，以及MDA、HNE 和HHE 含量与植物油氧化程度之间的关系，对不同植物油的中脂肪酸组成、传统氧化指标、3 种醛（MDA、HHE、HNE）进行主成分分析。如图4所示，第1 主成分F1 和第2主成分F2 的贡献率达100%。第1 主成分和第2主成分分别占总差异性的95.91%～97.57%和2.43%～4.09%，F1 贡献率最大。

由图4可知，植物油的氧化与亚油酸（ω-6）和亚麻酸（ω-3）等不饱和脂肪酸的过氧化作用密切相关。PO、CO、CLO 中从主成分F1 轴可清晰地看出MDA、HNE 与PUFA、ω-6 型脂肪酸表现出显著负相关（P＜0.05），即随着MDA 与HNE 生成量的增加，PUFA、ω-6 脂肪酸含量减少。MDA、HNE与其余指标均呈现正相关。由图4a、4b、4d可知，MDA 与PUFA 和ω-6 型脂肪酸的夹角小于HNE，说明MDA 与PUFA 和ω-6 型脂肪酸相关性低于HNE。又因为MDA 是ω-3 油氧化产生的主要次级产物，所以MDA 不适合用来评价亚麻酸含量低的油脂氧化，而HNE 可作为油脂氧化的新指标。如图4c、4e所示，RO 和LO 中目标醛类物质MDA、HEN 和HHE 与PUFA、ω-6、ω-3 均呈现负相关。由图1c、1e可知，RO 中HNE 含量高，LO 中HHE 含量最高。研究[29]发现亚麻酸（ω-3）可以促进亚油酸（ω-6）的氧化，可能是因亚麻酸与亚油酸的氧化存在竞争关系而导致RO 中HNE 的生成量较大。HHE 可作为亚麻酸含量高的油脂的氧化新指标。

对不同植物油的氧化指标进行聚类分析，结果如图4f所示。PO 与CLO 在0，15，30 d 时分布较集中，均分布于第4 象限，说明PO 与CLO 在此期间的氧化差异性较小。0 d 时RO、CO 和LO 集中在同一个区域，均分布于第3 象限，说明0 d 时3 种植物油中MDA、HNE、与HHE 的差异不显著。储藏15 d 的RO 和LO，与储藏30 d 的CO 均分布在第2 象限，说明RO、LO 氧化15 d 时醛类物质的生成量已达到CO 30 d 时的水平，由此可以准确区分CO 与RO、LO。因CO 中的不饱和酸主要以ω-6 亚油酸[30]为主，又因亚油酸是HNE 的前体物[31]，故HNE 可用来评价CO 的氧化。储藏30 d时LO、RO 分布同一区域，LO 中HHE 的含量远高于RO （图1c、1e），可准确区分LO 与RO，因此HHE 可用来评价LO 的氧化，即HNE、HHE 可作为特征指标来评价ω-6 和ω-3 脂肪酸的氧化。

图4 不同植物油储藏过程PCA 分析Fig.4 PCA analysis of different vegetable oil at storage processes

3 结论

对5 种植物油储藏过程中，MDA、HHE 和HNE 的生成情况以及作为氧化指标的适用性的研究表明：MDA 在LO 中的分布最广，PO、RO、CLO 及CO 中有少量MDA 检出。储藏过程中PO与CLO 中HNE 的生成量较少，而CO、RO 和LO中生成较多的HNE。HHE 主要分布在LO 中，RO中含量极少。研究发现植物油中的营养物质——生育酚虽可在一定程度上影响MDA、HNE 和HHE 的生成，但不是主要影响因素。同时研究发现，目标醛的生成与植物油不饱和脂肪酸组成密切相关，PCA 分析表明：MDA 与植物油不饱和脂肪酸的相关性较低（P<0.05），不适合作为油脂氧化指标。HNE、HHE 与不饱和脂肪酸的相关性高，可作为油脂氧化的新指标。PCA 聚类分析表明：HNE 可用于评价ω-6 型植物油氧化，HHE 可用来评价ω-3 型植物油的氧化。HHE 和HNE 可作为特征性指标反映植物油中ω-3 和ω-6 脂肪酸的消减。