HPLC 法测定不同生产厂家何首乌中二苯乙烯苷和蒽醌类成分的含量

代桂丽，陈言

（焦作市食品药品检验所中药室，河南 焦作 454000）

何首乌的主要功效为润肠通便、消痈等，在肠燥便秘、风疹瘙痒、疮痈等治疗中适用[1]。何首乌具有广泛的自然资源分布，主要产于广东、广西、贵州、四川等地。不同厂家何首乌来源不同、成分含量不同，功效有差异。为了在临床治疗中取得最佳效果，有必要积极采取有效手段对不同厂家何首乌中成分含量进行测定。本研究探讨了不同生产厂家何首乌中蒽醌类和二苯乙烯苷成分含量测定中高效液相色谱法（HPLC）的应用。

1 材料、仪器与方法

1.1 材料

何首乌饮片来源为2019年河南省专项监督抽验-中药材及中药饮片的抽验样品（样品1 来源于安徽药知源中药饮片有限公司，样品2 来源于河南省修之合药业有限公司，样品3 来源于安国安兴中药饮片有限公司，样品4 来源于民生药业集团珍医堂制药有限公司），均为蓼科植物何首乌的干燥块根切片。购买中国食品药品检定研究院研制的大黄素甲醚对照品、大黄素对照品、二苯乙烯苷对照品，含量为99.2%、98.7%、91.0%，批号分别为110758-201616、110756-201512、110844-201814。购 买 德国Merck 公司生产的乙腈、甲醇（色谱纯），磷酸、无水乙醇、95%乙醇、甲醇均为分析纯，自制纯化水。

1.2 仪器

电子分析天平（Sartorius CPA225D）、紫外检测器（Waters 2489）、高效液相色谱仪（Waters e2695），色 谱 柱（5 μm，Waters Xbridge C18，4.6 mm×250 mm），上海精宏实验设备有限公司生产的电热恒温鼓 风 干 燥 箱（DHG-9023A），IKA TUBE-MILL 100控制性试管研磨机，昆山超声仪器有限公司生产的KQ-300VDV 型双频数控超声波清洗器。

1.3 方法

1.3.1 蒽醌类成分测定

①制备对照品溶液：将适量大黄素甲醚对照品、大黄素对照品取出来，精密称定，将甲醇加入其中溶解，分别将46.82 μg/ml 大黄素甲醚、85.28 μg/ml 大黄素溶液制备出来。②制备供试品溶液：将1 g 左右过四号筛的本品粉末取出来，精密称定，在圆底烧瓶中置入，将50 ml 甲醇精密加入，将重量称定，加热回流1 h，取出，放冷，再次将重量称定，用甲醇将减失的重量补足，摇匀，滤过，将5 ml 续滤液取出来，将其设定为供试品溶液A，在游离蒽醌测定中应用。另将25 ml续滤液精密量取出来，在圆底烧瓶中置入，水浴蒸干，将20 ml 8%盐酸溶液精密加入其中，超声处理5 min，频率、功率分别为40 kHZ、100 W，将20 ml 二氯甲烷加入其中，水浴中加热回流60 min，取出，第一时间冷却，在分液漏斗中置入，对容器进行洗涤，在此过程中将少量二氯甲烷充分利用起来，洗液向分液漏斗中并入，将二氯甲烷液分取出来，再次用二氯甲烷振摇提取酸液3 次，每次15 ml，二氯甲烷液合并，将溶剂回收起来至干。用甲醇溶解残渣，向10ml量瓶中转移，将甲醇加入其中，到刻度，摇匀，滤过，将续滤液取出来，将其设定为供试品溶液B，在总蒽醌测定中应用。③色谱条件：色谱柱：5 μm，Waters Xbridge C18，4.6 mm×250 mm。流动相比例：甲醇∶0.1%磷酸=80∶20。流速、检测波长、柱温、进样量分别为1 ml/min、254 mm、35℃、10 μl。依据大黄素峰将理论塔板数计算出来，在3000 及以上。④专属性：将大黄素甲醚对照品溶液、大黄素对照品溶液、空白溶剂、供试品溶液A 取出来分别进样，将图谱记录下来。

1.3.2 二苯乙烯苷含量测定

①制备对照品溶液：将适量2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡糖苷对照品取出来，精密称定，将稀乙醇加入其中，将0.269 mg/ml 对照品溶液制备出来，备用。②制备供试品溶液：将0.2 g 左右过四号筛后的本品粉末取出来，精密称定，在圆底烧瓶中置入，将25 ml 稀乙醇精密加入，将重量称定，加热回流30 min，放冷，再次将重量称定，用稀乙醇将减失的重量补足，摇匀，静置，滤过，将续滤液取出来，即得。③色谱条件：色谱柱：5 μm，Waters Xbridge C18，4.6 mm×250 mm。 流动相比例：乙腈∶水=25∶75。流速、检测波长、柱温、进样量分别为1 ml/min、320 nm、35 ℃、10 μl。依据2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-Oβ-D-葡糖苷峰将理论塔板数计算出来，在2000 及以上。④专属性：将二苯乙烯苷空白溶剂、样品溶液、对照品溶液取出来，进样前用0.45 μm 微孔滤膜滤过，将图谱记录下来。二苯乙烯苷样品溶液、对照品溶液的保留时间均为约4.2 min，空白溶剂无干扰。

1.3.3 何首乌中蒽醌类和二苯乙烯苷成分含量测定

将不同厂家样品取出来，将总蒽醌、游离蒽醌供试液制备出来，依据色谱条件进样，对游离蒽醌、总蒽醌含量进行测定，结合蒽醌含量=总蒽醌含量-游离蒽醌含量。并将供试液制备出来，依据色谱条件进样，对二苯乙烯苷含量进行测定。

2 结果

2.1 蒽醌类成分测定

2.1.1 线性关系

将0.5 ml、1 ml、2 ml、4 ml、6 ml、8 ml 大黄素对照品溶液分别精密量取出来，在10 ml 量瓶中放置，向刻度稀释，在此过程中将甲醇充分利用起来，摇匀，依据色谱条件进样分析。将0.75 ml、1.5 ml、3 ml、5 ml、7 ml、9 ml 大黄素甲醚对照品溶液分别精密量取出来，在10 ml 量瓶中放置，向刻度稀释，摇匀后依据色谱条件进样分析。将横坐标设定为浓度，将纵坐标设定为峰面积，将回归方程计算出来，将标准曲线绘制出来。大黄素、大黄素甲醚的回归方程分别为y=36 943.31x+212（r=0.999 6）、y=34 930.18x+325（r=0.9999），0.0043～0.0682 mg/ml、0.004～0.042 mg/ml 范围内分别具有良好的线性关系。

2.1.2 稳定性试验

将供试品溶液A 取出来，依据色谱条件进样分析，定时进样，将1 d 内大黄素甲醚、大黄素峰面积记录下来，RSD=1.02%、0.98%，样品具有良好的稳定性。

2.1.3 精密度试验

将供试品溶液A 取出来，依据色谱条件进样分析，连续进样6 次，将大黄素甲醚、大黄素峰面积记录下来，RSD=0.76%、1.02%，仪器具有良好的精密度。

2.1.4 重复性试验

将6 份何首乌细粉分别称取出来，每份约1 g，将游离蒽醌供试液制备出来，依据色谱条件进样分析，将大黄素甲醚、大黄素峰面积记录下来，将含量、RSD 计算出来，平均含量分别为0.033%、0.087%，RSD=0.26%、1.11%，均具有良好的重现性。

2.1.5 加样回收率试验

将0.25 g 已知含量的何首乌粉末取出来，分取6 份，精密称定。将1.5 mg 大黄素对照品、0.5 mg 大黄素甲醚对照品精密称定，在10 ml 量瓶中分别置入，定容过程中将甲醇充分利用起来。将1ml 大黄素对照品溶液（0.15 mg 大黄素）、1 ml 大黄素甲醚对照品溶液（0.05 mg 大黄素甲醚）加入样品中，再次将23 ml 甲醇精密加入，称重，加热回流1 h，放冷，过滤，将续滤液取出来，将其设定为供试品，过滤过程中用0.45 μm 微孔滤膜滤过，进样，将峰面积记录下来，将回收率计算出来。大黄素的平均回收率为98.03%，RSD=0.86%，大黄素甲醚的平均回收率为95.46%，RSD=2.88%，具有良好的回收率。大黄素加样回收试验结果见表1，大黄素甲醚加样回收试验结果见表2。

表1 大黄素加样回收试验结果分析

表2 大黄素甲醚加样回收试验结果分析

2.1.6 检测限和定量限

将适量大黄素甲醚、大黄素标准溶液取出来，在10 ml 量瓶中置入，将甲醇加入其中，向刻度稀释，摇匀，将其设定为大黄素甲醚、大黄素检出限系列溶液。稀释对照品溶液后进样检测，将各色谱峰面积记录下来，将检出限、定量限检测标准分别设定为S/N=3、S/N=10，大黄素甲醚、大黄素的检出限分别为4.46 ng、10.07 ng，定量限分别为12.57 ng、34.02 ng。

2.2 二苯乙烯苷含量测定

2.2.1 线性关系

将二苯乙烯苷对照品溶液取出来，将1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、6 ml、8 ml 分 别 精 密 量 取 出来，在10 ml 量瓶中置入，向刻度稀释，摇匀，过滤过程中用0.45 μm 微孔滤膜滤过，向液相色谱仪注入，将峰面积记录下来。将横坐标设定为对照品浓度，将纵坐标设定为峰面积，将回归方程拟合出来，即y=38656071x+25198（r=0.9996），0.027～0.215 mg/ml 范 围 内 具 有良好的线性关系。

2.2.2 稳定性试验

将供试品溶液取出来过滤，在此过程中用0.45 μm 微孔滤膜滤过，定时进样，对1 d 内二苯乙烯苷峰面积进行测定，RSD=1.12%，1 d 内样品稳定。

2.2.3 精密度试验

将供试品溶液取出来过滤，在此过程中用0.45 μm 微孔滤膜滤过，连续进样6 次，对二苯乙烯苷峰面积进行测定，RSD=1.03%，仪器具有良好的精密度。

2.2.4 重复性试验

将6 份何首乌细粉分别取出来，每份0.2 g 左右，精密称定，将供试液制备出来，依据色谱条件进样，对峰面积进行测定，将含量计算出来，二苯乙烯苷平均含量为3.66%，RSD=0.98%，具有良好的重现性。

2.2.5 加样回收率

将0.05 g 左右已知含量的何首乌粉末称取出来，精密称定，平行6 份。另将8 mg 二苯乙烯苷对照品精密称定，在10 ml 量瓶中置入，溶解、定容过程中将稀乙醇充分利用起来。将1.5 ml 对照品溶液（1.2 mg 二苯乙烯苷）加入每份样品中，然后将11 ml 稀乙醇精密加入，称重，加热回流30 min，放冷，过滤，将5 ml 续滤液取出来，在10 ml 量瓶中置入，向刻度稀释，将其设定为供试品，依据色谱条件进样，对峰面积进行测定，将含量计算出来，平均加样回收率为96.58%，RSD=2.05%，回收率与要求相符。二苯乙烯苷加样回收试验结果见表3。

表3 二苯乙烯苷加样回收试验结果分析

2.2.6 检测限和定量限

将适量二苯乙烯苷标准溶液精密量取出来，在10 ml 量瓶中置入，将甲醇加入其中，向刻度稀释，摇匀，将其设定为二苯乙烯苷检出限系列溶液。稀释对照品溶液后进样检测，将各色谱峰面积记录下来，将检出限、定量限检测标准分别设定为S/N=3、S/N=10。二苯乙烯苷的定量限、检出限分别为97.58 ng、36.14 ng。

2.3 不同厂家何首乌中蒽醌类和二苯乙烯苷成分含量测定

样品1、样品2、样品3、样品4 中结合蒽醌含量分别为0.15%、0.20%、0.20%、0.25%，二苯乙烯苷含量分别为2.10%、2.60%、2.65%、2.48%，均与药典要求相符，具有较高的质量。

3 讨论

3.1 何首乌化学成分分析

二苯乙烯苷、含蒽醌类化合物等是何首乌的主要化学成分[3]。有研究表明[4]，二苯乙烯苷能够对老年痴呆、动脉硬化进行防治，促进记忆功能、免疫功能的提升、胆固醇的降低，对肝脏进行保护，将抗衰老作用发挥出来等。大黄素甲醚、大黄素等是蒽醌类主要成分，在植物体内存在的形式主要有两种，即糖苷结合态、游离态，能够促进免疫功能的提升，有抗肿瘤作用及肝毒性[5]。

3.2 不同厂家何首乌化学成分HPLC 检测结果分析

有研究表明[6]，何首乌生产厂家不同，其二苯乙烯苷、蒽醌类含量存在差异。本研究结果表明，样品1、样品2、样品3、样品4 中结合蒽醌含量分别为0.15%、0.20%、0.20%、0.25%，二苯乙烯苷含量分别为2.10%、2.60%、2.65%、2.48%，均与药典要求相符，药品含量稳定，具有较高的质量，和上述研究结果一致，说明HPLC 法具有良好的重现性、较高的准确性、较为快捷的操作，在评价何首乌药材及其复方制剂质量的过程中适用。

综上所述，不同生产厂家何首乌中蒽醌类和二苯乙烯苷成分含量均与药典要求相符，有较高的质量。蒽醌类和二苯乙烯苷成分含量测定中HPLC 在控制质量中起着重要作用，值得推广。