钝化剂与微生物及其联用对土壤重金属形态影响的研究进展

康馨，井永苹，张小村，孔凡美，耿立清，赵瑞君，李彦，

（1．山东农业大学资源与环境学院，山东 泰安 271018；2．山东省农业科学院农业资源与环境研究所，山东 济南 250100；3．农业农村部黄淮海平原农业环境重点实验室，山东 济南 250100；4．辽宁省农业科技成果转化服务中心，辽宁 沈阳 110013；5．招远市农业技术推广中心，山东 招远 265499）

目前重金属污染已成为我国环境污染中最为严重的问题之一，其危害之大，污染面积之广，影响程度之深远必须引起高度重视。据调查，我国重金属污染的土地面积占比高达64．8%，污水灌溉区占地面积高达140万hm2，每年因重金属污染所造成的粮食产量损失高达1 000万t以上［1］。此外，重金属可以通过食物链进入人体，影响人的身体健康，甚至威胁生命安全。例如，砷污染是导致人类不孕和流产、红细胞和白细胞产量下降的原因；铬污染导致中毒性肾炎、肝损伤和肺炎；镍污染导致哮喘、心脏病和肺栓塞；镉污染导致心理障碍、胃肠道疾病和DNA损伤［2］。

面对如此严峻的态势，如何修复重金属污染成为人们关注的焦点。与有机污染物不同，重金属一旦进入土壤，不能被分解转化成其他物质，只能在土壤中迁移转化为不同形态。重金属迁移到作物体内会造成严重的健康风险，如果能够在土壤中转化为生物活性低的形态，则能够极大地促进作物安全生产，这也是重金属污染修复的重要研究思路。当前，国内外对于重金属污染修复的方法主要包括：化学修复技术、物理修复技术、生物修复技术以及联合修复技术。其中，化学钝化技术是指在土壤中加入钝化剂，通过吸附沉淀反应，改变重金属的存在形态，从而降低重金属对作物的危害［3］。钝化剂因其具有成本低、见效快、可显著降低重金属在土壤中的移动性和生物有效性等成为重金属污染修复普遍采用的方法，一般可分为单一型钝化剂和复合型钝化剂。不同钝化剂的影响因素、作用效果均不一样，常用的钝化剂材料有海泡石、工业废渣、石灰、赤泥、生物炭和羟基磷灰石等［4］。

利用微生物功能治理重金属污染是一种创新的生态友好的方法。早在20世纪80年代初，就有学者提出此方法，微生物通过参与重金属的分解迁移、沉淀富集等过程［5，6］，改变重金属离子的形态，从而降低其毒性。适量浓度的重金属可以促进微生物群落的生长和繁殖，而高浓度的重金属将导致微生物数量的减少甚至灭亡［7］。

土壤中的微生物群落十分活跃，其繁殖速度快、代谢旺盛、对新环境反应迅速的特点可以将重金属污染物迅速转化为生物活性较低的形态，起到钝化重金属、修复土壤污染的作用。研究表明，若将根际微生物与钝化剂材料联合施用，可有效降低土壤中重金属的生物有效性。钝化剂可以作为微生物的载体［8］，增强微生物的活性，从而强化钝化剂修复重金属污染；还能为微生物提供碳源，增加其对碳源的利用效果。然而，目前国内外关于重金属污染的修复技术多以单一技术为主，钝化剂与微生物联合施用的复合技术研究尚处于探索阶段。本文分别就钝化剂和微生物对土壤重金属形态及其有效性的影响以及其联用的修复效果进行阐述，分析相关研究并加以整理，以期为后续重金属污染治理的研究与实践、促进作物生长和安全生产提供新的思路和途径。

1 重金属钝化剂的分类及其对重金属形态的影响

1．1 钝化剂分类及与重金属的作用机理

向污染土壤中加入不同钝化剂，通过一系列络合、吸附、沉淀、螯合、腐殖化、氧化还原或离子交换等反应，从而降低污染土壤中重金属的迁移率是修复重金属污染的有效途径。常见的钝化剂分为单一型和复合型两大类，其中单一型钝化剂主要包括无机类、有机类以及新型材料。常见的无机类钝化剂主要有磷酸盐类、含钙类、粘土矿物、金属材料类、工业废渣等；常见的有机类钝化剂主要来源于有机废物、生物炭等；新型材料一般指纳米材料、介孔材料等。复合型钝化剂包括矿物材料与微生物复合型、微生物与有机类复合型等。表1分别列举了近年来研究较多的几种重金属钝化剂及其作用机理。

表1 不同钝化剂的修复机理

1．2 钝化剂对土壤重金属形态的影响

重金属元素在土壤中的形态直接影响其生物可利用性，不同形态重金属将给土壤和环境带来不同影响。目前被普遍接受的是根据Tessier［24］提出的分布提取法研究重金属各形态，将重金属分为可交换态、碳酸盐结合态、铁-锰氧化物结合态、有机结合态和残渣态5种形态。其生物活性依次表现为：残渣态＜有机结合态＜铁-猛氧化物结合态＜碳酸盐结合态＜可交换态。其中可交换态和碳酸盐结合态重金属容易被植物和人体等生物受体吸收，对整个生态环境产生重要影响；而残渣态和有机结合态重金属比较稳定，不易被生物受体吸收［17，22］。因此，残渣态和有机结合态重金属的形成及其占比增加是重金属钝化的重要标志。熊仕娟等［25］通过盆栽试验表明，沸石处理使土壤中可交换态镉含量从72．0% ～88．0%显著降至30．0% ～66．4%，而增加残渣态、有机态镉含量。付煜恒等［26］以磷酸二氢钾、磷酸二氢钙和磷酸二氢铵3种磷酸盐为改良剂，采用重金属形态分析和X-射线衍射法探讨其对铅镉复合污染土壤的钝化效果，结果表明施用磷酸盐可使重金属元素Pb、Cd从可交换态向残渣态转化，显著降低Pb、Cd的生物可利用性，其中磷酸二氢钙钝化效果最好，对Pb、Cd的钝化率分别达到69．8%、35．2%。可见，钝化剂的施用能使生物活性较高的可交换态和碳酸盐结合态重金属转化为残渣态、有机结合态等低生物活性形态，从而显著降低重金属污染物的可迁移性及其危害，这也是利用其进行生物修复的主要依据。

2 微生物的分类及其对重金属的作用

2．1 土壤常见微生物种类的重金属耐受性

土壤中含有大量微生物，其中一些是能够降低重金属生物有效性的功能微生物群落，具有很强的重金属耐受性。当接触到重金属时，这些微生物会产生应激性反应，抑制重金属对植物产生毒害。目前大多数相关研究集中在真菌、细菌及放线菌上，不同类型微生物在根际的功能不同，对重金属的作用效果也各不相同。有关研究表明，微生物对重金属耐性强弱顺序为真菌＞细菌＞放线菌［27］。

2．1．1 真菌对土壤重金属污染的耐受性 根际真菌主要通过自身抗性及对重金属离子的吸附性来降低重金属毒性，因其生长速度快、抗逆性强、适应环境能力强等优点而被广泛应用。Field等［28］在工矿周围的土壤中发现腐殖质分解菌和菌根菌能够将大量Hg富集在胞内，大大降低Hg离子在土壤中的含量。在一些重度污染地区，真菌因对重金属耐性较强可成为优势种群。Zotti等［29］从硫矿附近铜污染严重的土壤中筛选出的哈茨木霉菌株对Cu2+的富集量高达19．628 g/kg。此外，根际真菌还可辅助宿主吸收更多营养并提高对重金属离子的耐受性。AM真菌可帮助宿主增强对重金属离子的耐受性，以免受其毒害［30］。

2．1．2 细菌对土壤重金属污染的耐受性 细菌是微生物群体中占比最大的一类，在根际环境中的细菌种类及数量一般均高于非根际区。Tkacz等［31］研究表明，根际区较非根际区为细菌提供了更好的生活环境，更适宜细菌生长和繁衍。一些细菌群落即使在高浓度重金属胁迫环境中也能存活，表现出极强的耐受性和吸附性。马薇等［32］发现蜡状芽孢杆菌在Cr2+浓度为200 mg/L的培养基上能快速生长，表明该菌株有很强的抗铬能力；而在铅、镉、铬离子浓度均为75 mg/L和锰离子浓度为100 mg/L的培养基中，也能正常生长。Li等［33］在高浓度镉污染土壤中发现耐重金属巨大芽孢杆菌H3和新根瘤菌属T1-17菌株能将水溶性镉降低79%～96%。

2．1．3 放线菌对土壤重金属污染的耐受性 放线菌也是土壤微生物重要组成部分，种类繁多且分布较广。有研究者在放线菌的代谢产物中发现一种絮状活性物质可以改变重金属离子的价态，进而降低重金属离子的生物有效性［34］。Amoroso等［35］对铜污染区的抗性链霉菌研究表明，该类菌株在土壤中分布广泛，对铜离子的耐受浓度高达1 000 mg/L，其主要通过溶解作用降低重金属毒性，对重金属离子有较强的耐受性。

这些微生物较强的重金属耐受性为其在重金属污染土壤中正常生长提供了基本保障，也为利用这些微生物进行污染修复提供了可能。此外，研究这些微生物的重金属耐受机理，还能为重金属污染土壤修复提供新的视角。

2．2 微生物对土壤重金属的耐受机理

研究表明，微生物降低重金属毒性的机理复杂，且方式繁多，同一属的不同菌株修复同种重金属污染的修复机理都不尽相同。目前研究较多的主要分为两大类：生物吸附和生物转化，微生物通过自身代谢活动或/和重金属接触后产生的生化反应来改变重金属离子的化学价态以降低其生物有效性。这是微生物对重金属较强耐受性的重要原因，也为利用微生物进行重金属活性钝化、修复污染土壤提供了可能。

2．2．1 生物吸附固定 目前，对于重金属生物吸附的研究大多在活细胞中进行，依据重金属离子与细胞发生反应的部位不同又分为胞内吸附、细胞表面吸附和胞外吸附。胞内吸附主要是指重金属离子与细胞内的一些金属硫蛋白、络合素和植物螯合肽等多肽结合生成沉淀、络合物等，从而将重金属离子固定在细胞内部。Banerjee等［36］研究表明，从严重污染土壤中发现的Enterobacter cloacae B1菌株有很强的胞内吸附能力，在高浓度重金属培养基上培养3天后，该菌株对Cd、Ni、Pb的胞内吸附量分别达到95．25%、64．17%、36．77%。细胞表面吸附是指细胞的细胞壁表面官能团及黏液层与金属离子发生络合、静电吸附等作用将重金属离子固定在细胞表面。Mauro等［37］研究表明，将酵母金属硫蛋白串联体表达在酵母细胞表面可以大大提高酵母细胞吸附重金属的能力。胞外吸附是指微生物代谢并分泌的胞外聚合物对重金属离子产生络合、沉淀作用，进而提高吸附效率。Pulsawat等［38］研究表明，胞外聚合物对Cu2+、Mg2+、Pb2+有很强的吸附作用，尤其对Pb2+有着很强的亲和力。Peng等［39］发现胞外聚合物对Cd2+的去除率可达10%。

2．2．2 生物转化 生物转化通过氧化还原、甲基化/去甲基化等作用改变重金属离子的化合价态、形态，进而降低重金属离子在土壤中的毒性及迁移性。氧化还原主要作用于多价态重金属，尤其在降低高价态重金属方面具有重要地位。Srivastava等［40］发现沙雷氏菌可将Cr6+转化为Cr3+并进行固定，有研究表明［41］Cr6+的生物有效性是Cr3+的100倍，因此沙雷氏菌可以大大降低其毒性。有些微生物将Hg2+还原为Hg，使其成为易挥发的状态或形成沉淀［42］。甲基化/去甲基化是转化重金属中较为关键的一个过程，其中具有代表性的是As和Hg。Visoottiviseth等［43］发现，青霉菌对砷的甲基化作用，可使砷挥发量高达43．94 μg/L。而汞却恰恰相反，去甲基化是降解汞污染的理想方式。Yang等［44］研究表明，很多种细菌对汞的去甲基作用使甲基汞脱除甲基，降解率达20%～84%。

3 钝化剂与微生物联用对土壤重金属污染的修复

3．1 联合修复的作用效果

钝化剂施入重金属污染土壤，不仅能直接降低重金属的毒性，还对土壤中的微生物有所影响，进而间接影响重金属的生物有效性，表明微生物对钝化剂的修复效果有一定促进作用。熊力等［45］研究表明，单一钝化剂施入对降低糙米中重金属含量效果不明显，而添加微生物后，可以使水稻糙米中镉和砷的含量分别降低46%和29%。然而不同种类的钝化剂对微生物群落功能的影响存在显著差异，具体实施时要合理搭配。例如在镉污染土壤中加入海泡石和石灰，微生物氮量显著降低，而加入钙镁磷肥后微生物氮量则显著提高［46］。

施入土壤中的钝化剂可以充当土壤微生物的载体，将游离的微生物在区域内固定，从而保持较高密度和活性，强化钝化剂的修复作用。戚鑫等［47］发现，将柠檬酸杆菌、蜡样芽胞杆菌和枯草芽孢杆菌3种菌株固定到生物炭内，可以大大提高这三种菌株去除铀、镉的能力。还有研究表明，通过向铜、镉污染的土壤中添加木炭、石灰等，不但降低铜、镉的生物有效性，还增加微生物优势种群的数量，增加微生物的多样性［48］。另外，钝化剂还可以向微生物提供碳源。杜志敏等［49］发现在铜污染的土壤中加入石灰，可有效提高微生物的碳源利用效果。施入钝化剂后，土壤中N、P、K等营养物质含量均增加，为微生物生长活动提供基质。

3．2 联合修复的影响因素

联合修复的效果受很多因素影响，主要因素是土壤的理化性质，包括土壤pH值、有机质含量、氧化还原电位（Eh）、阳离子交换当量（CEC）等；另外钝化剂和微生物的种类及数量也起着关键作用。

土壤pH值通过影响重金属沉淀溶解、络合吸附反应使重金属形态发生改变，从而严重影响钝化修复效果。一定范围内提高pH值，可交换态重金属含量降低，残渣态、有机结合态重金属含量升高［50］。pH值被视为影响重金属吸附量的重要变量，即使pH值的微弱变化也会引起重金属吸附量的巨大改变［51］，例如土壤pH值升高0．5个单位，对于Cd的吸附量将提高至原来的两倍［52，53］。另外土壤pH值还通过影响土壤微生物的丰度、活性和群落结构改变其环境毒性［54］。pH值较低时，大量的氢离子与重金属离子抢夺细胞壁的结合点位，降低了微生物对重金属的吸附量。

土壤有机质含有大量结合点位，可与重金属离子结合形成络合物，从而降低其生物有效性。Yin等［55］通过向水稻田施用籽饼粕等有机物料，显著降低水稻中的重金属含量。然而，随着土壤中可溶性有机质的大量增加，对于重金属的吸附容量和吸附率反而会降低。谭长银等［56］通过长期田间定位试验表明，长期施用有机肥的土壤中Cd与Zn的有效态含量随时间延长而逐年上升，由此推测土壤有机质可能对Cd和Zn有“活化作用”。另外有机质可以向微生物提供大量营养物质，有研究表明生物炭可以改变微生物的呼吸速率，增加微生物的生物量，从而改变土壤的理化性质［57］。

土壤氧化还原电位（Eh）通常通过控制土壤水分来调节。当土壤处于淹水环境时，高价态的铁、锰会被还原为低价态，从而导致大量铁、锰离子浸入土壤溶液［58］。土壤阳离子交换当量（CEC）也是影响重金属在土壤中形态转化的一个重要因素。有研究表明，大豆植株中的Pb含量会随着CEC的下降而显著增高［59］。

钝化剂的钝化效果与其种类及加入量有很大关系，同一钝化剂对不同重金属的钝化机理不同，不同钝化剂对同一重金属的作用效果也有差别。将不同钝化剂的靶向性作用于污染土壤并且掌握其用量才能够最大限度发挥钝化剂的作用。朱雁鸣等［60］用赤泥作为钝化剂处理污染土壤，结果证明5% 赤泥对Cd、Cu、Pb、As和Zn的生物有效性均有降低作用，其含量分别为对照的15．7%、38．6%、19．2%、36．0%和46．3%。

4 展望

单一使用钝化剂降低重金属毒性，促进植物生长，但是具有一定的局限性，与微生物联用，则能发挥出更大的潜力。目前联合修复尚处于试验阶段，在实际应用中仍存在一些问题，具有一定不确定性。后期应展开更深入的研究，为联合修复的应用提供理论依据和数据支撑。今后的研究需要进一步优化钝化剂和微生物组合，获得最佳修复效果。钝化剂和微生物的种类有很多种，只有将优势互补的钝化剂和微生物群落组合在一起，才能发挥出最大的作用。此外，还应综合考虑土壤环境等因素可能产生的影响，提早干预，规避可能出现的问题。针对钝化剂施用可能产生的环境风险，要考虑“富营养化”“拮抗作用”等带来的复合污染。