基于网络药理学与分子对接法分析熟地黄-山茱萸治疗糖尿病肾脏疾病的作用机制*

邢晨晨，张效威，徐江雁

河南中医药大学，河南 郑州 450046

糖尿病肾脏疾病(diabetic kidney disease，DKD)是糖尿病引起的严重微血管并发症，以持续性蛋白尿、水肿、高血压、肾功能持续性下降、心血管事件频发等为表现的临床综合征[1]，是全球慢性肾脏病的主要原因，也是目前导致终末期肾脏病(end-stage-renal-disease，ESRD)的首要原因[2]。调查结果显示，全球范围内约20%的糖尿病患者进展为DKD[3]，而我国DKD患病率高达40%[4]。DKD发展至后期需要进行血液透析，甚至肾脏移植，严重影响患者的生存质量，并且给家庭和社会带来沉重的经济负担。因此，尽早采取干预措施，阻止或延缓DKD病程进展至ESRD是目前治疗DKD的重要目标之一。临床实践过程中针对DKD的治疗主要以控制血压、降低血糖以及抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统等为主，然而上述治疗药物并不能有效阻止DKD的持续进展。中医药在防治DKD方面有明显的优势，能够有效减少蛋白尿生成，延缓病程进展，保护肾功能等。

熟地黄-山茱萸是治疗肾病的常用药对[5]，也是益肾通络方中具有补益肝肾功能的重要药对。熟地黄性味甘温，入肝肾经，既能补益肝肾、填精益髓，又能补血养虚；山茱萸味酸涩质润，温而不燥，补益肝肾，既能益精助阳，还能收敛固涩。现代药理研究表明，熟地黄能调节血脂、血糖，并对心脑血管系统、血液系统、中枢神经系统、免疫系统等有良性调节作用[6]。山茱萸能保护肝肾功能，对神经、心脑系统具有保护作用等[7]。网络药理学利用系统生物学、计算生物学和多向药理学等技术方法，构建成分-靶点-疾病网络，研究药物对疾病的分子作用机制，为中药复杂成分的研究提供了有效方法[8]。分子对接技术是采用计算机技术，通过化学计量学方法模拟配体与受体之间的几何匹配、能量匹配，并计算二者之间的结合力，以寻找二者最佳的结合模式[9]。基于此，本研究利用网络药理学对熟地黄-山茱萸治疗DKD的分子作用机制进行探讨，并利用分子对接方法进行验证，以期为熟地黄-山茱萸防治DKD药效机制的阐释以及深入开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 熟地黄-山茱萸有效成分筛选通过中药系统药理学数据库及分析平台[10](traditional Chinese medicine systems pharmacology，TCMSP)和中药分子机制的生物信息学分析工具[11](bioinformatics analysis tool for molecular mechanism of traditional Chinese medicine，BATMAN-TCM)以及中药综合数据库(traditional Chinese medicines integrated database，TCMID)，以“熟地黄”和“山茱萸”为关键词进行检索。对TCMSP数据库检索到的相关成分以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥20%[12]、类药性(drug-like，DL)≥0.1[13]为条件进行筛选。对BATMAN-TCM数据库和TCMID数据库检索到的化学成分通过Pubchem数据库[14]获取成分的Canonical SMILES号保存并导入SwissADME[15](http：//www.swissadme.ch/)，借助该平台对熟地黄和山茱萸的有效成分进行筛选，同时查阅《中华人民共和国药典》(2020版)及中国知网相关文献补充被遗漏的活性成分。

1.2 熟地黄-山茱萸活性成分的作用靶点和DKD靶点的获取通过TCMSP和BATMAN-TCM数据库获得有效成分的靶点信息。利用蛋白质数据库Uniprot[16](http：//www.uniprot.org)对收集到的靶点信息进行标准化处理，设定“reviewed”和物种为“Homo Sapiens”，将靶点转化为对应的基因名称。利用SwissTargetPrediction[17](http：//www.swisstargetprediction.ch/)和STITCH平台预测相关化合物的潜在靶点。将以上4个数据库检索到的化合物靶点合并，删除重复基因，得到熟地黄-山茱萸活性成分的作用靶点。以“diabetic kidney disease”为关键词，搜索OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man)数据库[18](http：//www.omim.org)、DisGeNet数据库[19](http：//www.disgenet.org/home/)、DRUGBANK数据库[20](http：//www.drugbank.ca/)、Gene-Cards数据库[21](https：//www.genecards.org)得到相关靶点。将4个数据库获得疾病靶点合并后删除重复靶点，获得DKD靶点。将熟地黄-山茱萸活性成分的作用靶点和DKD靶点进行映射，得到熟地黄-山茱萸治疗DKD的潜在作用靶点。

1.3 熟地黄-山茱萸活性成分-DKD靶点PPI网络构建将熟地黄-山茱萸治疗DKD的潜在作用靶点上传至STRING数据库[22](http：//string-db.org)，选择物种为“Homo Sapiens”，选择靶点关联置信度为0.70，并隐藏游离节点，进行蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)分析，构建PPI网络，将获得的数据导入Cytoscape3.8.2软件制作PPI网络图。

1.4 熟地黄-山茱萸干预DKD的富集分析将熟地黄-山茱萸干预DKD的潜在作用靶点导入DAVID数据库[23](https：//david.ncifcrf.gov/)，进行基因本体(gene ontology，GO)功能富集分析、京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，设置P<0.05进行筛选，最终选取符合条件的前10位GO功能条目和前20位KEGG通路条目，利用微生信平台进行可视化制图，并利用Cytoscape 3.8.2软件构建靶点-信号通路网络图。

1.5 熟地黄-山茱萸干预DKD的关键成分与核心靶点的分子对接将进行分子对接关键成分的sdf格式文件利用OpenBabel-3.1.1转化为pdb格式文件。利用RCSBPDB数据库[24](https//：www.rcsb.org/)下载靶点蛋白的三维晶体结构。利用分子对接模拟软件Autodock Tools1.5.6对蛋白及化合物进行去水、加氢、计算电荷数等前期处理后进行对接模拟计算。若结合能<0 kcal·mol-1表明靶点蛋白与化合物自然状态下可自发结合，结合能<-1.2 kcal·mol-1表明靶点蛋白与化合物对接结果良好，结合能越小，表明化合物与蛋白之间结合能力越佳。通过Pymol软件对得分较高且构象较稳定的对接结果进行可视化。

2 结果

2.1 熟地黄-山茱萸活性成分及干预DKD靶点预测获得熟地黄活性成分11种，山茱萸活性成分42种，同时检索得到与53种活性成分相对应的靶点175个。此外，根据数据库检索结果，得到4 232个与DKD治疗相关的靶点。将熟地黄-山茱萸有效成分对应的175个靶点与4 232个DKD关联靶点，利用Venny2.1进行映射后，获得100个共同靶点(见图1)。

图1 熟地黄-山茱萸与DKD共同靶点韦恩图

2.2 熟地黄-山茱萸潜在活性成分-靶点-疾病网络构建利用Cytoscape 3.8.2软件构建熟地黄-山茱萸干预DKD的“活性成分-靶点-疾病”网络，见图2，菱形代表疾病，圆形代表靶点，六边形代表活性成分。网络中共有活性成分节点53个，靶点节点100个，节点中相互作用的边358条。根据网络拓扑学性质分析结果显示，多种成分干预一个靶点，一种成分也能干预多个靶点，体现了熟地黄-山茱萸多成分、多靶点干预DKD的协同作用机制，主要成分拓扑分析指标见表1。

注：蓝色为活性成分，粉色为靶点，绿色为疾病图2 熟地黄-山茱萸干预DKD的成分-靶点-疾病网络图

表1 熟地黄-山茱萸关键成分网络节点特征参数

2.3 PPI网络构建及关键靶点筛选通过STRING和Cytoscape 3.8.2软件对100个交集靶点进行分析处理后，得到共有99个节点和962条边的PPI网络，网络中每个节点的大小和颜色的深浅反映其度值的大小(图3)。通过拓扑学性质分析，度值排名前10位的关键靶点分别为AKT1、TP53、VEGFA、JUN、CASP3、PPARG、STAT3、ESR1、PTGS2、FOS，具体拓扑参数见表2。

图3 熟地黄-山茱萸干预DKD的PPI网络

表2 熟地黄-山茱萸主要活性成分靶点网络节点特征参数

2.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析通过DAVID平台对100个交集靶点进行GO功能富集分析(P<0.05)，共得到408条条目，其中生物过程(biological process，BP)295条，分子功能(molecular function，MF)77条，细胞组分(cell composition，CC)36条，各类别排名靠前的条目见图4，长度越长表示富集在该条目上的基因越多，颜色越深表示富集越显著。通过GO功能富集分析推测其细胞组分主要涉及胞质溶胶、核染色质、质膜、核质、转录因子复合体等方面；生物过程主要涉及针对药物反应、雌二醇反应、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、一氧化氮生物合成过程的正调控、老化、缺氧反应等方面；分子功能主要涉及酶结合、蛋白质结合、转录因子结合、类固醇结合等方面。通过KEGG通路分析得到P<0.05的通路共89条，结合DKD的疾病特点，提示熟地黄-山茱萸可能通过HIF-1信号通路、细胞凋亡相关信号通路、p53信号通路、PI3K-Akt信号通路、T细胞受体信号通路等发挥治疗DKD的作用，选取富集程度高的前20条通路进行可视化，气泡越大，表示富集在该条通路上的基因越多，颜色越深表示富集程度越显著，见图5。利用Cytoscape 3.8.2软件制作熟地黄-山茱萸干预DKD的活性成分-靶点-信号通路网络图，见图6，进一步说明靶点和信号通路对熟地黄-山茱萸防治DKD的重要作用。

注：绿色为BP分析；黄色为 CC分析；紫色为 MF分析图4 熟地黄-山茱萸干预DKD关键靶点GO功能富集分析柱状图

2.5 分子对接为进一步验证关键靶点与成分的可靠性，根据疾病，选取β-谷甾醇、豆甾醇、汉防己甲素作为分子对接药效成分分别与核心靶点AKT1(PDBID：1UNQ)、TP53(PDBID：6VIP)、VEGFA(PDBID：5DN2)、JUN(PDBID：5QS8)、CASP3(PDBID：3H0E)进行分子对接模拟计算，结果显示，关键靶点与药效成分最低结合能均<-1.2 kcal·mol-1，说明预测的成分和靶点均有良好的对接活性，见表3，其中对接得分最高的是JUN-豆甾醇，分值为-9.27 kcal·mol-1，得分最低的是VEGFA-汉防己甲素，分值为-4.72 kcal·mol-1。将以上对接结果通过Pymol软件对得分较高且构想象较稳定的靶蛋白与化合物对接结果进行可视化，见图7。

图5 熟地黄-山茱萸干预DKD关键靶点KEGG功能富集分析气泡图

图6 熟地黄-山茱萸干预DKD活性成分-靶点-信号通路网络图

表3 熟地黄-山茱萸核心成分与关键靶点分子对接结果

注：A：AKT1-豆甾醇；B：AKT1-汉防己甲素；C：TP53-汉防己甲素；D：VEGFA-β谷甾醇；E：JUN-豆甾醇；实线为氢键作用；虚线为疏水作用图7 熟地黄-山茱萸成分与核心靶点分子对接结果(部分)

3 讨论

DKD发病隐匿，是糖尿病微血管并发症之一。肾小球硬化和肾间质纤维化是其最主要的病理改变。DKD发病机制复杂，至今仍不明确，可能涉及糖代谢异常、微循环障碍、氧化应激、炎症反应、细胞自噬等方面[25]。近年来，研究发现中医药干预DKD在改善肾功能，减轻蛋白尿，延缓病程进展，提高患者生活质量等方面有重要作用。

通过对熟地黄-山茱萸治疗DKD活性成分和关键靶点的网络药理学研究发现，熟地黄-山茱萸中有53个潜在活性成分可能通过100个关键靶点对DKD起到治疗作用，主要成分包括β-谷甾醇、豆甾醇、汉防己甲素、没食子酸等。其中β-谷甾醇及豆甾醇度值排名靠前，β-谷甾醇为山茱萸中的活性成分，在每100 g山茱萸中含量高达56.4 mg，构成比为92.6%[26]；豆甾醇为熟地黄中的活性成分，虽未查到熟地黄与豆甾醇的含量研究，但已有研究证实，二者治疗DKD作用显著[27-28]，推测其可能为熟地黄-山茱萸防治DKD的关键活性成分。同时，分子对接结果显示，β-谷甾醇、豆甾醇、汉防己甲素与关键靶点VEGFA、AKT1、CASP3、TP53、JUN均有良好的对接活性。研究发现，在链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠模型治疗中，汉防己甲素可能通过激活Nrf2/HO-1信号通路，发挥其抗炎、抗氧化应激等作用，从而减少蛋白尿，降低尿素氮，有效抑制糖尿病发展进程，延缓肾脏损害[29]。β-谷甾醇属于植物甾醇类化合物，具有抗炎、抗氧化、调节骨代谢、调节免疫等多种药理作用。研究表明，β-谷甾醇能增加酪氨酸磷酸酶的活性，降低核因子-κB水平，减少趋化因子的表达，同时增强抗炎因子白细胞介素-10的活性，从而减轻炎症反应[30]。β-谷甾醇具有保护肾脏的作用，它能够降低尿素、尿酸、肌酐等生化参数指标以及改善肾小管坏死等肾脏病理变化[27]。豆甾醇具有抗糖尿病、抗氧化的特性，有助于预防糖尿病及其肾脏并发症。研究表明，豆甾醇通过改善氧化应激，调节抗氧化酶水平，在预防糖尿病及其并发症中起到重要作用[28]。豆甾醇可能通过抑制甲状腺激素的释放，从而刺激胰岛素的分泌，实现降低血糖的目的[31]。研究表明，没食子酸通过抑制氧化应激反应，能够有效降低甲基乙二醛诱导的糖尿病肾病小鼠的血糖水平，改善病理组织，减少蛋白尿，保护肾功能，延缓糖尿病肾脏疾病的发展进程[32]。没食子酸对血管紧张素转化酶有抑制作用，而血管紧张素转化酶抑制剂已广泛用于DKD的临床治疗，能有效调节肌酐、尿素氮的水平，改善肌酐清除率，保护肾功能[33]。由此推测，这些度值排名靠前的化合物可能是熟地黄-山茱萸发挥治疗DKD作用的关键成分。

通过STRING数据库获得PPI网络信息提示，熟地黄-山茱萸干预DKD的关键靶点涉及AKT1、CASP3、VEGFA、TP53、PPARG、JUN等。研究表明，链脲作菌素诱导的糖尿病肾病模型小鼠使用CASP3抑制剂(Z-DEVD-FMK)8周后，DKD小鼠的蛋白尿、肾小管间质纤维化以及肾功能可得到有效改善[34]。因此，推测熟地黄-山茱萸可能通过抑制CASP3的信号通路，实现减少肾细胞凋亡，保存残余肾单位，达到保护肾功能的作用。研究表明，VEGFA是糖尿病肾病血管功能障碍的关键因子，能够保护血管内皮细胞，预防DKD肾功能损害和组织学改变[35]。VEGFA通过减少肾小球基底膜阴离子数量，干预肾小球内皮细胞小窗形成，进而影响肾小球基底膜电荷屏障和机械屏障，使肾小球滤过膜对血浆蛋白的通透性增加，导致蛋白尿的形成[36]。AKT1能够调控细胞增殖、迁移、凋亡等多种生物过程，能够调控葡萄糖的摄取[37]。研究表明，调节 AKT1能够修复肾小管上皮细胞，从而减轻细胞凋亡和炎症反应，保护肾功能[38]。PPARG能够调节全身的脂质代谢，参与脂肪细胞分化和维持葡萄糖水平，与糖尿病、肥胖、心血管疾病密切相关[39]。

GO功能富集分析结果表明，熟地黄-山茱萸防治DKD涉及多个生物学过程，主要集中于药物反应、雌二醇反应、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、一氧化碳生物合成的正调控、凋亡过程的负调控等。KEGG通路富集分析显示，熟地黄-山茱萸干预DKD的信号通路主要包括HIF-1信号通路、细胞凋亡信号通路、p53信号通路、PI3K-Akt信号通路、T细胞受体信号通路等。HIF-1α是HIF-1信号通路上的关键靶点，抑制HIF-1α的释放能减轻高糖培养大鼠模型的肾小球系膜细胞的炎症及纤维化[40]。HIF-1信号通路能调节VEGFA，进而修复肾组织微小血管损伤，最终改善肾脏缺血缺氧的状态，达到延缓肾纤维化的目的，实现保护肾功能的作用[41]。PI3K-Akt信号通路具有调节细胞增殖、凋亡与自噬的重要作用。研究表明，PI3K-Akt信号通路能够调控足细胞的凋亡，而足细胞具有维持正常肾小球滤过膜形态和功能的作用，通过抑制足细胞的凋亡可能实现抑制肾小球硬化以及肾间质纤维化，达到减少蛋白尿，保护肾功能的目的[42]。HIF与P13K/AKT等信号通路相互作用，能够共同参与肾纤维化的调节。研究表明，通过调节p53信号通路，可能抑制高糖诱导足细胞的损伤与凋亡，从而起到延缓DKD病程进展的作用[43]。

综上，本研究基于网络药理学的方法，探讨了熟地黄-山茱萸防治DKD的作用机制及活性成分发挥作用的药效物质基础，结果表明，熟地黄-山茱萸治疗DKD的潜在活性成分有β-谷甾醇、豆甾醇、汉防己甲素、没食子酸等，核心靶点有AKT1、CASP3、VEGFA、TP53、PPARG、JUN等，通过调节HIF-1信号通路、细胞凋亡信号通路、p53信号通路、PI3K-Akt信号通路、T细胞受体信号通路等干预DKD，并利用分子对接技术对潜在成分与关键靶点的相互作用能力进行验证。在网络药理学研究中，由于活性成分筛选的标准不一，预测靶点的方法不同，数据搜集是否全面等，都会对结果产生影响。本研究是以TCMSP数据库用户指南2021年更新的建议进行熟地黄-山茱萸活性成分的筛选，但未考虑药物的剂量以及煎煮等问题。因此，预测的结果仍需通过相应的药效机制实验进行验证。