羌活胜湿汤治疗强直性脊柱炎的网络药理学分析*

许晓娜，许二平，王晓鸽，2

1.河南中医药大学，河南 郑州 450046； 2.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000

强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)属于风湿免疫系统疾病，患者主要是青壮年男性[1]，可引起继发性骨量减少甚至骨质疏松[2]，亚洲国家发病率为1.67%[3]，其中我国发病率约为0.2%～0.4%[4]。虽然AS的发病率不是很高，但此病有致畸的可能性[5]，须引起重视。强直性脊柱炎的病因病机尚未完全阐明，多认为与遗传因素和环境因素相关。研究发现，HLA-B27、MHC、IL23R、ERAP1、KIF12B、RUNX3、TNF等为AS的遗传易感基因[6-12]，核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)、白细胞介素-23(interleukin-23，IL-23)/辅助性T细胞17(T helper cell 17，Th17)[13]等相关通路与AS的发生发展关系密切。此外，微生物感染也是引起AS的重要原因，目前研究较多的有肺炎克雷伯菌感染[14]、衣原体感染[15]等。

羌活胜湿汤由羌活、独活、藁本、甘草、蔓荆子、防风、川芎组成，搭配经典，配伍巧妙，方中羌活擅长祛除上半身风湿，独活擅长祛除下半身风湿，两药合用，则一身风湿尽除，疏通关节而能通痹止痛，同为君药；防风和藁本俱为祛风药，防风祛风除湿以解表，藁本辛散温通散寒湿邪，两药合用，助羌活、独活祛风胜湿之力，为臣药；川芎辛温香燥，走而不守，能活血行气，祛风止痛，蔓荆子祛风除湿利关节，合为佐药；炙甘草为使药，调和诸药；全方共奏祛风胜湿之效，临床治疗强直性脊柱炎效果显著，但其作用机理尚未明确，本文采用网络药理学方法预测其作用靶点，探讨其可能的作用机理。

1 资料与方法

1.1 羌活胜湿汤活性成分检索在中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)依次检索羌活、独活、藁本、甘草、蔓荆子、防风、川芎的化学成分，以口服利用度(oral availability，OB)≥30%、类药性(drug likeness，DL)≥0.18为条件进行筛选，得到羌活胜湿汤的活性成分，并通过TCMSP数据库进一步预测所有活性成分的潜在靶点，将获得的靶点数据录入UniProt蛋白质数据库进行标准化。采用Cytoscape3.8.2 软件，构建“药物-成分-靶点-疾病”网络图。

1.2 强直性脊柱炎相关靶点的获取在GeneBank数据库(https：//cipotato.org/genebankcip/)及人类基因数据库(https：//www.genecards.org/，GeneCards)以“Ankylosing Spondylitis(AS)”为关键词进行检索，获取强直性脊柱炎的相关靶点。采用Venn2.1.0(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)在线平台获取药物靶点和疾病靶点的交集靶点，即为羌活胜湿汤治疗强直性脊柱炎的潜在靶点。

1.3 蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络图构建把药物和疾病的交集靶点导入STRING(https：//string-db.org/)在线数据库，物种设置为人(Homo sapiens)，构建交集靶点之间的蛋白互作网络图。

1.4 富集分析将交集靶点导入Metascape(https：//metascape.org/gp/index.html)在线数据库，物种设置为智人(Homo sapiens)，选择自定义分析，进行基因本体(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，并将富集结果可视化。

2 结果

2.1 羌活胜湿汤活性成分筛选在TCMSP检索得到羌活胜湿汤组方中药的化学成分，以OB≥30%和DL≥0.18为标准进行筛选，得到羌活胜湿汤活性成分61个，其中羌活10个，独活6个，甘草16个，藁本1个，蔓荆子14个，防风10个，川芎4个；预测得到羌活胜湿汤活性成分相关靶点265个。

2.2 疾病靶点及药物治疗AS的潜在靶点的获取通过检索 GeneBank和 GeneCards 数据库，去掉重复值后得到疾病靶点1 672个。将羌活胜湿汤活性成分的相关靶点与强直性脊柱炎疾病相关靶点进行映射，得到26个交集靶点，即为羌活胜湿汤治疗强直性脊柱炎的潜在靶点，使用Venn图对结果进行可视化。见图1。

2.3 “药物-成分-靶点-疾病”网络图利用 Cytoscape3.8.2 软件构制“药物-成分-靶点-疾病”网络图，图中共有 311个节点，其中药物活性成分61个，药物节点6个(藁本成分只有一个且为共同成分，故未显示)，靶点节点239个。图中浅青色代表独活活性成分，浅黄色代表蔓荆子活性成分，浅橘色代表防风活性成分，浅绿色代表甘草活性成分，浅粉色代表川芎活性成分，棕色代表羌活活性成分，浅蓝色代表靶点。

图1 交集靶点的Venn图

注：QH：羌活；DH：独活；GC：甘草；FF：防风；CX：川芎；MJ：蔓荆子图2 “药物-成分-疾病-靶点”网络图

2.4 PPI 网络图将交集靶点导入STRING数据库构建蛋白质相互作用关系网络图，图中共有26个节点，101条边，平均节点数为7.77，节点代表靶蛋白，边代表靶蛋白之间的相互作用关系。见图3。

2.5 GO功能富集分析利用Metascape数据库对羌活胜湿汤作用于强直性脊柱炎的有效作用靶点进行GO功能富集分析得到GO条目620条，其中生物学过程(biological process，BP)有475条，主要有脂质生物合成过程、对有毒物质调节激素水平的反应、辅助因子代谢过程等；分子功能(molecular function，MF)共124条，主要是影响酶的活性，如氧化还原酶活性、类固醇羟化酶活性等；细胞组成(cellular component，CC)共21条，涉及细胞质核周区、细胞器包膜囊腔、线粒体包膜等。见图4-图6。

图3 交集靶点的PPI 网络图

图4 GO富集分析中的BP分析图

图5 GO富集分析中的MF分析图

2.6 KEGG通路富集分析利用Metascape在线数据库对羌活胜湿汤治疗强直性脊柱炎的有效作用靶点进行KEGG通路富集分析。以P<0.05、FDR<0.05为标准进行筛选，共得到28条信号通路，主要有类固醇激素生物合成通路、NOD样受体信号通路、Toll样受体信号通路等。见表1。

表1 KEGG通路结果分析

图6 GO富集分析中的CC分析图

3 讨论

中医认为强直性脊柱炎肾虚为本，病在督脉[16]。国家中医药管理局2010年制定的《22个专业95个病种中医诊疗方案》中将本病分为肾虚督寒型及肾虚湿热型。督脉阳气不足，风、寒、湿、热等邪入侵，督脉起于胞中，行于脊背，肾阳不足，则督脉无以主一身之阳经，同时阳虚寒凝，寒则痛甚，故脊背痛甚[17]。因此，中医将AS归属于“痹证”“大偻”“骨痹”“竹节风”“龟背风”“肾痹”“脊强”“筋痹”“督脉病”“背偻”“腰痛”等范畴[18-20]。《黄帝内经》记载：“骨痹不已，复感于邪，内舍于肾，肾痹者，尻以代踵，脊以代头”，意指不能直立行走，臀部代替双足，脊柱弯曲程度严重，从远处看像头一样，形象的描述了本病引起的脊柱及髋关节的畸形。《黄帝内经》中还记载“阴气者，开阖不得，寒气从之，就生大偻”。王冰著说“身体俯曲，不能直立，偻，脊柱弯曲”，也是对本病的描述。中医认为痹症的外因是风寒湿，风寒湿三气杂至，合而为痹，内因与禀赋不足，先天肾精亏虚，督脉空虚有关，内外邪气相合，阻碍机体阳气运行，不通则痛而发病。因此，AS临床治疗时扶正祛邪兼顾，方能治本。羌活胜湿汤有祛风胜湿之效，临床治疗AS效果显著。

网络药理学研究显示，川芎通过调节NOD样受体(NOD-like receptors，NLRs)、T细胞受体、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、Toll样受体(Toll-like receptors，TLR)、环磷腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)、磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K-Akt)等信号通路治疗AS[21]。川芎的成分之一杨梅素具有免疫调节的作用，有益于疼痛性疾病的治疗[22]，可以下调NF-κB结合活性，从而抑制脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的IL-12的产生[23]。研究发现，独活治疗AS有26个关键靶点[24]，其中人类白细胞抗原B27(human leucocyte antigen-B27，HLA-B27)和白细胞介素 23 受体(interleukin-23 receptor，IL-23R)基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)[25]是AS发病的公认假设；Toll样受体、NF-κB、NOD样受体、肠道免疫、T细胞受体等是治疗AS的免疫相关通路；脂肪因子、Janus激酶(janus kinase，JAK)/信号转导与转录激活因子(signal transducer and activator of transcription，STAT)通路等是治疗炎症的通路；Wnt /β-catenin 信号[26]、TNF、破骨细胞分化、类固醇激素的合成等是治疗骨代谢的相关通路。姜平等[27]的数据挖掘分析显示，治疗AS最常用的组合是独活-防风，应用网络药理学分析此药对共含有21个有效成分，对应靶点237个，其中关键成分可能是β-谷甾醇、汉黄芩素等。段凯旋等[28]研究显示，羌活-独活药对共有15个抗炎成分，作用于49个靶点，共同参与47个生物过程。谢恒韬等[29]研究发现，在大鼠模型中，羌活能够降低炎症中NF-κB的水平，和强直性脊柱炎的发病相关。以上研究表明，羌活、独活、防风等羌活胜湿汤的组方药材均可通过多成分、多靶点、多途径发挥治疗AS的作用。

本文探讨了中药复方羌活胜湿汤治疗AS的可能靶点和通路发现，疾病和药物的交集靶点有26个，羌活胜湿汤主要成分有升麻素苷、阿魏酸、甘草苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、甘草酸、羌活醇、藁本内酯、蛇床子素等，通过调节NOD样受体、T细胞受体、肿瘤坏死因子-α、Toll样受体、环磷腺苷、类固醇激素的合成等通路，作用于HLA-B27和 IL-23R SNP等强直性脊柱炎疾病靶点。说明羌活胜湿汤可通过多途径、多靶点、多层次作用于AS。该研究为深入理解药物-靶点之间相互作用提供了重要参考信息，同时为中医药治疗强直性脊柱炎的机制研究做出探索。