竹节参总皂苷调控TRPC6表达对高糖诱导的内皮细胞损伤的影响*

王今今，曹德云，王璐璐，常昕昱

铁岭市中心医院，辽宁 铁岭112000

糖尿病已成为一种全球性的重大健康问题。心血管疾病是2型糖尿病最常见的并发症，其发病率和死亡率常常高于其他并发症[1]。血管内皮细胞是维持心血管稳态的关键细胞，在高糖刺激下，线粒体电子传递链中活性氧的产生增加，引起氧化应激。由于机体抗氧化防御机能减弱，进而导致内皮功能损伤和功能障碍[2-3]，在糖尿病心血管并发症的发生发展中起着至关重要作用。但目前临床仍缺乏有效的治疗对策。

竹节参为五加科人参属多年生草本植物，是我国民间常用中药，竹节参总皂苷(total saponins of panax japonicus，SPJ)是其主要活性成分。现代药理学研究表明，SPJ是一种具有较强自由基清除能力的抗氧化剂，具有减轻炎症、降血糖、抑制细胞凋亡的作用[4-5]。有文献报道，SPJ IVa具有明显的胰岛素增敏活性，对2型糖尿病及其并发症具有潜在治疗作用[6]。因此，本研究通过观察SPJ对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞EVC-304损伤的影响，探讨其潜在分子机制，以期为防治糖尿病心血管病变提供参考。

1 材料

1.1 细胞EVC-304细胞(上海慧颖生物科技有限公司，货号：11668019)。

1.2 药物与试剂竹节参(亳州亿弘堂药业有限公司，货号：18226912020)。DMEM高糖培养基、优质北美胎牛血清(美国Gibco公司，货号：11965092、12483020)；瞬时受体电位阳离子通道蛋白6(transient receptor potential cation channel 6，TRPC6)小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)及其阴性对照(si-NC)(广州锐博生物公司，货号stB0005258A-1-5、siN0000001-1-10)；TRPC6过表达质粒(pcDNA-TRPC6)、质粒空载体(pcDNA)(上海泽叶生物科技有限公司，货号：ZY1001、ZY1002)；丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量检测试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性检测试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GPX)活性检测试剂盒(北京索莱宝生物科技公司，货号：BC0020、BC0175、BC1195)；Annexin V 凋亡检测试剂盒(FITC/PI双染法)、放射免疫沉淀测定(radioimmunoprecipitation assay，RIPA)裂解液、Trizol试剂[生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：E606336、C500005、B511311]；PrimeScriptTM逆转录试剂盒、SuperReal荧光定量预混试剂(大连takara生物公司，货号：RR037A、FP216)；兔源TRPC6抗体、兔源磷酸甘油醛脱氢酶(phosphoglyceraldehyde dehydrogenase，GAPDH)抗体、兔源B细胞淋巴瘤(B cell lymphoma 2，Bcl-2)抗体、兔源Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)抗体、山羊抗兔IgG[上海艾博抗(上海)贸易有限公司，货号：ab62461、ab245355、ab59348、ab53154、ab205718]；Lipofectamine 2000(北京沃比森科技有限公司，货号：11668019)；二喹啉甲酸(bicinchorninic acid，BCA)法蛋白定量试剂盒(上海联迈生物工程有限公司，货号：LM80815-500)。

1.3 仪器FACSCanto II型流式细胞仪(美国BD公司)；7500型荧光定量PCR仪(美国ABI公司)；DYY-12C电泳仪电源、DYCZ-20H垂直电泳槽、DYCZ-40A电转仪(北京六一仪器厂)；mμlISKANMK3型酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)。

2 方法

2.1 SPJ制备参照覃玉娥等[7]方法制备SPJ，具体如下：将竹节参粉碎，按照质量体积比110加入60%乙醇提取后，用正丁醇萃取、浓缩，将获得的正丁醇浸膏溶于水，过D101大孔树脂，依次用水、30%乙醇、60%乙醇、90%乙醇冲洗，取60%乙醇洗脱部位，经硅胶柱层析分离、三氯甲烷-甲醇梯度洗脱后，烘干洗脱液，即获得竹节参总皂苷。实验时用无菌水配置所需浓度，过滤除菌后备用。

2.2 细胞培养、实验分组EVC-304细胞采用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基于5%CO2、37 ℃ 恒温细胞培养箱中培养。当细胞密度达到80%时按照13比例进行传代，每周换液2～3次，取对数期细胞进行实验。采用葡萄糖浓度为 5.5 mmol·L-1的培养基培养细胞48 h记为对照组；采用葡萄糖浓度为30 mmol·L-1的培养液培养细胞48 h记为高糖组；竹节参总皂苷低、中、高剂量组为分别给予含50 mg·L-1、100 mg·L-1、200 mg·L-1的SPJ与30 mmol·L-1葡萄糖的培养基共同处理细胞48 h；EVC-304细胞分别转染si-NC、si-TRPC6，转染成功后收集细胞，采用葡萄糖浓度为30 mmol·L-1的培养液培养细胞48 h记为 si-NC 组、si-TRPC6组；EVC-304细胞分别转染si-NC、si-TRPC6，转染成功后收集细胞，用含 200 mg·L-1的SPJ与30 mmol·L-1葡萄糖的培养基共同处理48 h后记为竹节参总皂苷+pcDNA组、竹节参总皂苷+pcDNA-TRPC6组。细胞转染参照Lipofectamine 2000使用标准流程进行。

2.3 MDA含量及SOD、GPX活性的检测分别收集上述各组EVC-304细胞至离心管中，加入提取液，超声波破碎细胞，离心收集上清液。参照试剂盒标准流程测定MDA含量及SOD和GPX活性。

2.4 流式细胞术检测细胞凋亡收集按照上述分组进行处理的各组EVC-304细胞，并悬浮在适量的结合缓冲液中，调整细胞密度为1×106mL-1。将 5 μL 的Annexin FITC、PI分别加到100 μL的细胞悬液中，避光条件下孵育15 min，随后补加400 μL结合缓冲液，混匀后采用流式细胞仪分析细胞凋亡情况。

2.5 RT-qPCR检测TRPC6mRNA的表达水平用Trizol试剂提取各组EVC-304细胞的总RNA。用PrimeScript逆转录试剂盒将适量总RNA逆转为cDNA，以cDNA为扩增模板，按照SYBR Premix Ex Taq使用说明进行qPCR反应，反应体系：10×PCR Buffer 2.5 μL，MgSO42.5 μL，dNTPs 2.5 μL，正反向引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，RNase-Free ddH2O补足体系至25 μL；反应条件：95 ℃预变性60 s，95 ℃变性60 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共36次循环。采用2-ΔΔCt法分析TRPC6mRNA 的表达水平。引物序列见表1。

表1 引物序列

2.6 Western Blot检测TRPC6、Bcl-2和Bax蛋白表达水平用RIPA裂解液提取各组EVC-304细胞的总蛋白，收集上清液，BCA法测定蛋白浓度。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后转移至聚偏氟乙烯膜上。将膜在5%脱脂牛奶中封闭 1 h，孵育一抗(TRPC6、Bcl-2和Bax的稀释比例为1800、11 000、11 000)，4 ℃过夜。二抗(稀释比例为13 000)孵育1 h，用增强型化学发光试剂盒进行显色反应。以GAPDH为内参，凝胶成像系统分析目的蛋白的相对表达水平。

3 结果

3.1 SPJ对高糖诱导的内皮细胞氧化损伤的影响与对照组比较，高糖组EVC-304细胞上清液中MDA含量显著升高(P<0.05)，SOD和GPX活性显著降低(P<0.05)；与高糖组比较，竹节参总皂苷低、中、高剂量组EVC-304细胞上清液中MDA含量显著降低(P<0.05)，SOD和GPX活性显著升高(P<0.05)，且呈剂量依赖性。见表2。

表2 SPJ对高糖诱导的内皮细胞氧化损伤的影响

3.2 SPJ对高糖诱导的内皮细胞凋亡的影响与对照组比较，高糖组EVC-304细胞凋亡率、Bax蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达水平显著降低(P<0.05)；与高糖组比较，竹节参总皂苷低、中、高剂量组EVC-304细胞凋亡率、Bax蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，且呈剂量依赖性。见表3，图1。

表3 SPJ对高糖诱导的内皮细胞凋亡的影响

注：a：凋亡相关蛋白表达图；b：细胞凋亡流式图；A：对照组；B：高糖组；C：竹节参总皂苷低剂量组；D：竹节参总皂苷中剂量组；E：竹节参总皂苷高剂量组图1 SPJ对高糖诱导的内皮细胞凋亡的影响

3.3 SPJ对高糖诱导的内皮细胞中TRPC6表达的影响与对照组比较，高糖组EVC-304细胞TRPC6mRNA、TRPC6蛋白的表达水平显著升高(P<0.05)；与高糖组比较，竹节参总皂苷低、中、高剂量组EVC-304细胞TRPC6mRNA、TRPC6蛋白的表达水平显著降低(P<0.05)，且呈剂量依赖性。见表4，图2。

注：A：对照组；B：高糖组；C：竹节参总皂苷低剂量组；D：竹节参总皂苷中剂量组；E：竹节参总皂苷高剂量组图2 TRPC6蛋白表达图

表4 SPJ对高糖诱导的内皮细胞中TRPC6表达的影响

3.4 抑制TRPC6表达对高糖诱导的内皮细胞损伤的影响与si-NC组比较，si-TRPC6组EVC-304细胞中TRPC6蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，MDA含量、凋亡率、Bax蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，SOD和GPX活性、Bcl-2蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。见表5，图3。

3.5 过表达TRPC6逆转SPJ对高糖诱导的内皮细胞损伤的作用与高糖组比较，竹节参总皂苷组MDA含量、凋亡率、Bax及TRPC6蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，SOD和GPX活性、Bcl-2蛋白表达水平显著升高(P<0.05)；与竹节参总皂苷+pcDNA组比较，竹节参总皂苷+pcDNA-TRPC6组MDA含量、凋亡率、Bax及TRPC6蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，SOD和GPX活性、Bcl-2蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。见表6，图4。

表5 抑制TRPC6表达对高糖诱导的内皮细胞损伤的影响

注：A：TRPC6和凋亡相关蛋白表达图；B：细胞凋亡流式图图3 抑制TRPC6表达对高糖诱导的内皮细胞凋亡的影响

表6 TRPC6过表达逆转SPJ对高糖诱导的内皮细胞损伤的作用

注：a：TRPC6和凋亡相关蛋白表达图；b：细胞凋亡流式图；A：高糖组；B：竹节参总皂苷组；C：竹节参总皂苷+pcDNA组；E：竹节参总皂苷+pcDNA-TRPC6组图4 TRPC6过表达逆转SPJ对高糖诱导的内皮细胞凋亡的作用

4 讨论

研究表明，葛根素、淫羊藿苷等中药活性成分具有免疫增强、调节内分泌、改善心脑血管等多种生物学功能，被认为对糖尿病心血管病变具有潜在治疗作用[8-11]。SPJ是近年国内外学者研究的热点中药活性成分，研究指出，SPJ可降低D-半乳糖诱导的大鼠大脑衰老，减轻自然衰老大鼠大脑的神经炎症反应，逆转自然衰老大鼠结肠内紧密连接蛋白表达的减少[12-13]。SPJ还能改善肝功能，降低血清脂质水平，在预防肝纤维化方面具有巨大潜力[14]。此外，SPJ在心脑血管疾病防治方面疗效显著，其通过清除氧化应激引起活性氧的过度生成和积累，减轻心肌缺血损伤和心肌细胞凋亡，改善心脏组织形态和功能，对心肌缺血损伤大鼠具有明显的心脏保护作用[15-16]。本研究显示，SPJ呈剂量依赖效应地升高抗凋亡蛋白Bcl-2表达，降低促凋亡蛋白Bax表达，减弱高糖诱导的EVC-304细胞凋亡。糖尿病心血管疾病与氧化应激密切相关，在高糖刺激下过量活性氧生成和积累会改变细胞膜的通透性，使细胞结构破坏和脂质过氧化，最终导致关键酶的丢失，从而引起细胞损伤[17]。MDA是细胞膜脂质过氧化的终产物，其含量高低是反应细胞损伤程度的指标[18]。SOD和GPX是细胞内对抗氧化损伤的第一道防线，其活性降低可导致细胞内活性氧的过度累积，进而激活Caspase途径，促进细胞凋亡发生[19-21]。本研究显示，SPJ能够降低高糖诱导的EVC-304细胞中MDA含量，升高SOD和GPX活性，并呈明显的量效关系。表明SPJ能够拮抗高糖诱导的内皮细胞凋亡和氧化应激损伤。

TRPC包括TRPC1～TRPC17，是细胞膜上Ca2+的非特异性阳离子通道，其通过与G蛋白偶联受体结合，调节细胞内Ca2+水平，参与调节平滑肌和内皮细胞功能[22-25]。Chen等[26]研究显示，TRPC6的激活可能是导致轻度脑损伤内皮功能障碍的关键因素，使用TRPC6抑制剂对脑损伤致内皮功能障碍具有显著的保护作用。Lang等[27]发现在高糖诱导的视网膜毛细血管内皮细胞中TRPC6表达增加，抑制TRPC6能够阻止高糖诱导的视网膜毛细血管内皮细胞增殖、迁移和管腔形成，是糖尿病视网膜病变潜在治疗靶点。本研究发现，高糖诱导后，EVC-304细胞中TRPC6表达显著升高，而SPJ呈剂量依赖效应地降低高糖对TRPC6表达的促进作用，提示SPJ对高糖诱导的内皮细胞损伤的保护作用与调控TRPC6表达有关。进一步研究显示，抑制TRPC6表达可降低细胞凋亡率，减轻高糖诱导的EVC-304细胞损伤和凋亡。此外，过表达TRPC6还能够减轻竹节参总皂苷对高糖诱导的EVC-304细胞损伤的保护作用。以上研究结果表明，SPJ对高糖诱导的内皮细胞的保护作用可能与调控TRPC6表达有关。

综上所述，SPJ通过下调TRPC6的表达提高血管内皮细胞的抗氧化能力，减轻高糖诱导的血管内皮细胞凋亡和损伤，为SPJ用于防治糖尿病心血管病变提供了实验依据。