肾消方对糖尿病肾病大鼠肾脏损伤的干预作用*

职小飞，张克清，李相中

1.郑州大学第一附属医院附属安阳医院，河南 安阳 455003； 2.安阳市中医院，河南 安阳 455003

糖尿病目前已成为第三大危及公众健康的慢性非传染类疾病，至2020年底，我国成年人群体中，糖尿病患者数量约为1.14亿[1-2]。1型糖尿病与2型糖尿病病人中存在肾病问题的比例分别为 15%～25%、30%～40%，庞大的糖尿病患者基数导致糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)的高发、多发，给社会与家庭造成负担。DN患者除糖尿病的“三多一少”表现外，还出现高血压、持续性白蛋白尿、进行性肾功能损伤等症状[3-5]。肾消方由生黄芪 30 g，地龙10 g，人参10 g，桔梗10 g，桂枝 6 g，牛膝15 g，升麻10 g，赤芍10 g，桃仁10 g与川芎10 g等组成，是在补中益气汤及血府逐瘀汤的基础上进行加减变化而成。补中益气汤出自李东垣所著《脾胃论》[6]，血府逐瘀汤的出处为《医林改错》[7]，在王清任所创的“逐瘀汤”系列方中，此方剂应用率最高。近年来，已有临床报道补中益气汤及血府逐瘀汤对于DN有一定疗效，但二者化裁方肾消方对DN的作用效果鲜有临床报道。因此，本实验旨在探究肾消方能否改善DN大鼠肾损伤，为临床应用与机制探究提供理论依据。

1 材料

1.1 动物90只清洁级雄性SD大鼠，体质量100～140 g，由河北省实验动物实验室提供，动物许可证号：SCXK(冀)2013-1-003。实验大鼠饲喂于温度22～25 ℃、相对湿度40%～60%、12 h交替照明的环境下，饮水、饮食不限制。本研究经郑州大学第一附属医院附属安阳医院动物伦理委员会批准，批准号：2019DWLL-023。

1.2 药物与试剂生黄芪、地龙、人参、桔梗、桂枝、牛膝、升麻、赤芍、桃仁、川芎(北京同仁堂药店)；厄贝沙坦片(规格：0.15 g，杭州赛诺菲制药有限公司，批号：4A293)；链脲佐菌素(streptozocin，STZ，上海源叶生物科技有限公司，批号：200324)；酒精醋酸福尔马林混合(FAA)固定液(上海歌凡生物科技有限公司，批号：200127)；尿蛋白(urine total protein，UTP)测定试剂盒(青岛市三凯医学科技有限公司，批号：200115)；血肌酐(serum creatinine，Scr)测定试剂盒(合肥莱尔生物科技有限公司，批号：190923)；尿素氮(urea nitrogen，BUN)测定试剂盒(北京盒子生工科技有限公司，批号：200413)；尿酸(uric acid，UA)测定试剂盒(上海沪峥生物科技有限公司，批号：191103)；总蛋白(total protein，TP)测定试剂盒[艾博抗(上海)贸易有限公司，批号：200214]；白蛋白(albumin，ALB)检测试剂盒(BCG比色法，上海羽哚生物科技有限公司，批号：020128)；醋酸铀(西安鼎天化工有限公司，批号：190324)；柠檬酸铅(上海一基实业有限公司，批号：210114)；尿肌酐(urine creatinine，Ucr)检测试剂盒(干化学法，上海翰联医疗技术股份有限公司，批号：200615)；糖原PAS染色试剂盒(上海紫一试剂厂，批号：191221)。

1.3 仪器MDF-382E型医用超低温冰箱(日本三洋电机公司)；LD4-2A型低速离心机(离心半径：13.5 cm，北京医用离心机厂)；TEC-2800型自动组织包埋机(上海精密仪器仪表厂)；47MICROM-340E型石蜡切片机(德国Zeiss公司)；BM-10型显微镜(上海光学仪器一厂)；EMUC7型超薄切片机(德国Leica公司)；BX63+DP72型正置研究级显微镜(日本OLYMPUS公司)；7600-020型全自动大型生化分析仪、H-7650型透射电子显微镜(日本HITACHI公司)。

2 方法

2.1 肾消方水煎液的配制向药材中加入8倍量的水，浸泡0.5 h后，武火煮开，文火煎煮40 min，对药液进行过滤处理；药渣中加入6倍量水，煎煮 0.5 h 后，过滤取滤液，然后将两次药液充分混合。通过煎煮将肾消方药液浓缩为浓度分别是 1 g·mL-1、2 g·mL-1与4 g·mL-1的溶液。

2.2 模型制备、分组与给药90只雄性SD大鼠适应性喂养7 d后，随机选取10只大鼠为正常组，普通饲料饲养；其余80只大鼠采取高脂高糖饲料饲喂的同时腹腔注射小剂量STZ建立DN模型[8]。6周后检测造模大鼠的血糖，若血糖值≥16.7 mmol·L-1，表示DN建模成功。造模过程中，大鼠死亡6只，剔除血糖值<16.7 mmol·L-1的大鼠2只。随机将造模成功的大鼠分成模型组(n=15)、厄贝沙坦组(n=14)及肾消方低(n=14)、中(n=14)、高(n=15)剂量组。分组完成后对大鼠进行相应药物灌胃干预处理，参照药物成人临床应用剂量，根据人与大鼠体表面积法对大鼠灌胃剂量进行计算[9]，则肾消方低、中、高剂量组大鼠分别以5.63 g·kg-1、11.26 g·kg-1、22.52 g·kg-1的剂量灌胃给予肾消方溶液，厄贝沙坦组大鼠以14.12 g·kg-1的剂量灌胃给予厄贝沙坦，模型组和正常组灌胃给予等体积的纯净水，每天1次，连续给药20周。

2.3 肝功能、肾功能的检测每只大鼠采集3 mL血液，通过离心处理，分离血清，采用全自动大型生化分析仪对TP、Scr、ALB、UA与BUN进行测定。

2.4 24 h UTP的检测通过代谢笼留取大鼠24 h尿液，3 500 r·min-1离心10 min，取上清，根据UTP检测试剂盒说明书操作，借助终点法对尿中蛋白浓度进行测定，蛋白浓度与尿量的乘积即为24 h UTP值。

2.5 内生肌酐清除率(creatinine clearance rate，Ccr)的计算通过全自动大型生化分析仪对20周末每组实验动物尿肌酐(urine creatinine，Ucr)水平进行测定，计算大鼠的Ccr，以此反映肾小球的滤过能力。

2.6 肾小球体积的计算将肾组织于FAA固定液内固定处理24 h，充分流水冲洗，脱水、浸蜡，最后石蜡包埋处理，切片，调整为2 μm厚度，PAS染色液染色，光镜下进行观察，并借助软件CellSens Dimension以光镜下拍到的照片为对象通过逐点描绘区域法对肾小球面积进行测定，取5个肾小球面积的平均值为该只大鼠肾小球平均面积(mean glomerular area，MA)，并计算肾小球体积(glomerular volume，GV)。

GV=MA×1.5×0.75+0.21

2.7 透射电镜观察肾脏病理变化取左侧肾脏下端，将其切为等体积的小块，固定、脱水，石蜡包埋，超薄切片机完成切片，用醋酸铀与柠檬酸铅进行双重荧光染色处理，借助透射电镜观察肾小球基底膜增厚、足突融合、系膜基质增生等病理性改变，并进行拍照留存。

3 结果

3.1 肾消方对DN大鼠肝功能、肾功能的影响与正常组比较，模型组大鼠Scr、BUN及UA的水平显著升高(P<0.01)，ALB、PT的水平无明显变化；与模型组比较，肾消方低剂量组大鼠BUN及UA的水平显著降低(P<0.05)；肾消方高剂量组大鼠UA的水平显著降低(P<0.05)。见表1，图1。

表1 各组大鼠肝功能、肾功能对比

3.2 肾消方对DN大鼠内生肌酐清除率及肾小球体积的影响与正常组比较，模型组Ccr、GV水平显著升高(P<0.01)；与模型组比较，厄贝沙坦组及肾消方低、中、高剂量组Ccr、GV水平显著降低(P<0.05)；与厄贝沙坦组比较，肾消方低、高剂量组GV水平显著降低(P<0.05)。见图1。

注：A：各组ALB的结果图；B：各组TP的结果图；C：各组Ccr的结果图；D：各组GV的结果图；与对照组相比，**P<0.01；与模型组相比，△P<0.05，△△P<0.01；与厄贝沙坦组相比，□P<0.05，□□P<0.01图1 肾消方对DN大鼠肾功能及肾小球体积的影响

3.3 肾消方对DN大鼠24 hUTP定量的影响与正常组比较，模型组大鼠4周、8周、12周、16周、20周时的24 hUTP水平显著升高(P<0.01)；与模型组比较，厄贝沙坦组及肾消方低、中、高剂量组大鼠4周、8周、12周、16周、20周时的24 hUTP水平显著降低(P<0.05)；与厄贝沙坦组比较，肾消方低剂量组大鼠16 W、20W时的24 hUTP水平显著降低(P<0.05)；与肾消方低剂量组比较，肾消方中剂量组大鼠16周、20周时的24 hUTP水平显著升高(P<0.05)，肾消方高剂量组大鼠20周时的 24 hUTP 水平显著升高(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠24 hUTP的比较

3.4 肾消方对DN大鼠病理变化的影响光镜下观察发现：正常组大鼠肾脏结构无异常，肾小球囊腔宽大；模型组大鼠肾小球肥大且囊腔狭窄，一些节段存在球囊粘连现象，系膜基质分布增多，系膜区宽度增加，基底膜厚度增加(图2红色箭头所示)，肾小管上皮细胞肿胀，肾间质部分纤维化(图2黑色箭头所示)。电镜下观察显示：正常组大鼠肾脏超微结构正常，足突(图3红色箭头所示)整齐分布，未见融合现象；模型组大鼠肾小球基底膜厚度增大，足突重度融合，系膜基质增生。与模型组比较，各给药组大鼠的病理改变均有不同程度的减轻。见图2、图3。

注：A：正常组；B：模型组；C：厄贝沙坦组；D：肾消方低剂量组；E：肾消方中剂量组；F：肾消方高剂量组图2 光镜观察各组大鼠肾组织结构(PAS染色，×400)

4 讨论

DN多为糖尿病患病日久而致，基本病机以脾气虚弱、清气下陷致精微下趋为主，多数患者还兼夹瘀血等标证，因此应以健脾益气、升清活血为治法[10]。肾消方包括生黄芪、地龙、人参、桔梗、桂枝、牛膝、升麻、赤芍、桃仁与川芎等，是在补中益气汤以及血府逐瘀汤的基础上进行加减变化而成。本方取补中益气汤立意补气升阳为法，以黄芪为君，一是补气健脾以治气虚之本，二是升提下陷阳气，以求浊降清升，脾胃和调，精微物质能化生充足，水谷精气生化有源，诸症可以自愈。张山雷[11]在《本草正义》中说黄芪能“补益中土，温养脾胃，凡中气不振，脾土虚弱，清气下陷者最宜”。升麻佐助升举清阳，《本草纲目》曰“升麻引阳明清气上行，此乃察赋虚弱，元气虚馁，及劳役饥饱，生冷内伤，脾胃引经最要药也”。柯琴[12]《名医方论》曰：“元气不足，懒言，气喘，人参以补之”，方中运用此法旨在纠正气虚，人参为补阴之品，非炽热之药，方中人参气味甘微寒，能补太阴之生气，使阳得阴助而生化无穷。通过配伍升麻可使黄芪、人参的补益作用最大限度发挥，既切合早期DN的主要病机，又可照顾兼夹症。桃仁破血行滞润燥，红花活血化瘀止痛，为临床活血行气常用组合，两药与泽泻共为血府逐瘀汤的君药；赤芍、川芎助桃仁、红花活血祛瘀之功，牛膝活血通经，祛瘀止痛，引血下行。两方相和，对以脾气虚弱、清气下陷致精微下趋为主、兼夹瘀血等证的DN达到标本兼治目的。现代药理学研究表明。黄芪、人参、桃仁、川芎、赤芍、牛膝、地龙等具有改变血液动力学异常、抑制血小板黏附、保护肾小球、增加肾动脉灌流量、改善微循环、抑制肾小球硬化等作用[13-18]。

通过观察肾脏病理能够发现，肾消方能够使DN大鼠肾脏损伤有所改善，可减慢肾脏纤维化与肾小球硬化进展速度。相关研究证实，DN蛋白尿和病人病理改变、临床指标存在联系，可较为准确的体现肾小球与肾小管间质病变状况，同时可对肾脏预后进行评估[19-21]。对于糖尿病肾病而言，蛋白尿为其病情进展的独立风险因子，其进行性增多可导致病情加重，如果长期未获得有效控制，可导致肾功能受损，产生终末期肾病[22-23]。故而，对于糖尿病肾损伤的防治，蛋白尿的积极有效治疗发挥着关键作用。本研究结果表明，在糖尿病病程延长的同时，蛋白尿排泄随之增多，在不同阶段，肾消方均能够使蛋白尿的排泄降低。

Ccr是评估肾小球滤过功能的一项最常用指标，正常情况下，肾脏可有效清除血液中的内生肌酐[24]。DN初期存在肾小球高灌注压、高滤过表现。GV作为肾功能评价的常用指标，DN时GV水平明显升高。本研究结果发现，20周末时模型大鼠的肾脏Ccr上升，CV增大，说明其肾脏处在高灌注压与高滤过水平，而经药物干预后，各组呈现不同程度的下降，证实肾消方可有效调节糖尿病肾病大鼠Ccr、GV水平，减轻肾小球肥大，在一定程度上改善肾损伤。肾功能是肾脏排泄机体内部代谢垃圾，维持机体酸碱、电解质(包括钙、钾与钠等)平衡的功能[25]，通常通过24 hUTP、Scr、BUN与UA等指标进行评估。本研究显示，模型组大鼠24 hUTP、Scr、BUN、UA的水平明显升高，而经药物干预后其水平降低，提示肾消方可有效降低24 hUTP水平，并在一定程度上对大鼠Scr、BUN、UA水平起到调节作用，使DN大鼠肾功能得到改善。但最新研究证实，高尿酸血症和肾脏病、糖尿病间存在显著相关性，高尿酸会导致糖尿病病人的并发症(包括DN等)提前发生[26]，因此，及时有效的治疗高尿酸症极大程度上有助于DN的防治。

综上所述，肾消方对糖尿病肾病瘀血阻络证大鼠肾损伤具有良性干预作用，可使DN大鼠蛋白尿排泄减少，肾小球高灌注压、高滤过情况得到改善，降低肾脏肥大指数，改善肾脏病理变化，对肾功能起到保护作用。