春尺蠖海藻糖转运蛋白基因AcinTret1和AcinTret1-like的克隆、分子特性与表达分析

陈龙 娜仁格日乐 戴桂香 李红 闫国欣

摘要：海藻糖作为昆虫的血糖，不仅对增强其在抵御外界不利环境中的能力起着重要作用，还可为昆虫的生长发育和繁殖提供能量。海藻糖转运体（Tret）在从脂肪体等海藻糖产生组织向消耗组织转运过程中起着重要作用。为深入探究Tret基因在春尺蠖（Apocheima cinerarius）低温胁迫中的作用，研究基于已有春尺蠖幼虫转录组数据（不同低温胁迫条件），克隆获取Tret1和Tret1-like基因，分别命名为AcinTret1和AcinTret1-like（GenBank登录号：MZ689788、MZ689789），对基因的分子特征进行分析，同时构建系统进化树，最后对其在不同低温胁迫下的表达谱进行分析。结果显示，春尺蠖AcinTret1、AcinTret1-like基因编码蛋白序列（CDS）全长分别为1 926、1 533 bp，分别编码641、510个氨基酸，二者均具有主要协同转运蛋白超家族（major facilitator superfamily，简称MFS）的保守结构域，在N端均不含信号肽，但均具有12个跨膜区。系统进化结果表明，春尺蠖AcinTret1和AcinTret1-like基因分别与其他昆虫的Tret1和Tret1-like基因聚为一类，且AcinTret1与同为鳞翅目尺蛾科的冬尺蠖（Operophtera brumata）的亲缘关系最近，Tret1-like则与同为鳞翅目的粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）的亲缘关系最近。基因表达分析结果显示，AcinTret1和AcinTret1-like基因的表达量均在-10 ℃达到最大值，其次为25 ℃，呈现先下降后上升的趋势。由研究結果可以看出，2个Tret1基因在春尺蠖抵御低温胁迫调控中扮演重要角色，该研究结果有助于探索春尺蠖低温胁迫中调控海藻糖代谢的机制，为进一步揭示春尺蠖低温胁迫的分子机制奠定基础。

关键词：春尺蠖;海藻糖转运蛋白;低温胁迫;表达分析;AcinTret1;AcinTret1-like

中图分类号：S433.4   文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2022）10-0023-07

海藻糖作为昆虫的血糖，在昆虫生长发育和抵抗外界不利环境等过程中扮演着重要角色[1-5]。昆虫体内的海藻糖主要依靠TPS-TPP途径合成，在此途径中需要海藻糖合成酶（trehalose-6-phosphate synthase，TPS）的催化，而海藻糖的分解只有在海藻糖酶的作用下才能实现。海藻糖酶作为昆虫体内唯一可以分解海藻糖的酶，可分为可溶型海藻糖酶（TRE1）和膜结合型海藻糖酶（TRE2）[6]。目前，关于海藻糖代谢的研究大多集中于海藻糖的合成或分解[7]，缺乏血糖-海藻糖转运过程的系统、深入的研究。在昆虫体内，不是所有物质都像水或者脂肪一样可以不依赖任何载体直接穿过细胞膜，作为昆虫的能源物质，海藻糖和葡萄糖需要一种载体——糖转运蛋白（sugar transporter，ST）才能在细胞膜内外顺利进出，进而发挥作用。糖转运蛋白隶属于主要协同转运蛋白超家族（major facilitator superfamily，简称MFS），葡萄糖转运蛋白、海藻糖转运蛋白就是其中的2种。海藻糖转运蛋白在动植物中均被证明具有重要作用，如糖转运蛋白与植物果实的成熟有关联，在昆虫体内，海藻糖转运蛋白1（trehalose transporter1，Tret1）可以根据细胞内外的浓度梯度来运输海藻糖[8-9]。海藻糖不仅可以在昆虫生长发育过程中提供能量，而且发挥着抵抗外界寒冷的作用。越冬期昆虫体内的海藻糖含量显著高于非越冬期，说明可以通过调节昆虫体内的海藻糖含量来提高昆虫的抗寒能力，而海藻糖的含量与海藻糖转运蛋白密切相关。

春尺蠖（Apocheima cinerarius）是内蒙古地区近些年来暴发成灾的新害虫，为鳞翅目尺蛾科杂食性昆虫，在内蒙古地区以危害柠条为主，是我国多个省（市、自治区）重点监测的牧草、林木和经济树种害虫[10-11]。近年来，春尺蠖危害对象呈现扩大趋势，已经从危害杨、桑、柳、柠条、果树等林木发展到开始危害玉米、小麦等农作物，危害区域开始由北方的内蒙古、新疆等地区逐渐向南方的四川、云南等地区迁移危害。幼虫最早于4月上旬开始发生危害，此时当地昼夜温差较大，最低温度可达-10 ℃，幼虫能在如此环境中生存下来且发生危害，与其极强的抗寒性密切相关。为了深入了解海藻糖转运蛋白与春尺蠖生长发育的关系及其在低温胁迫中的作用，本研究利用笔者所在实验室已测春尺蠖3龄幼虫的转录组数据，克隆获取2个海藻糖转运蛋白基因，对其进行生物信息学分析，构建Tret1的系统进化树，同时分析其在不同温度处理下的表达谱，以期明确海藻糖转运蛋白在春尺蠖低温胁迫中的作用，为进一步揭示春尺蠖响应低温胁迫的分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

春尺蠖雌雄成虫在2020年春季采集于内蒙古巴彦淖尔市乌拉特前旗柠条草场（108°45′23.63″E，40°46′4.19″N），带回实验室后在室温下用柠条锦鸡儿雌雄成对饲喂，将其所产卵置于恒温（22±1） ℃、光—暗周期18 h—6 h、相对湿度55%～59%的 PRX-350C 智能型人工气候箱（产自宁波海曙塞福实验仪器厂）中卵育，将孵化出的幼虫用柠条锦鸡儿连续饲养，待幼虫发育至3龄时，取供试幼虫（蜕皮后2 d），分别在-10、-5、0、5、25 ℃各处理1 h，用液氮速冻后存于-80 ℃冰箱内备用。

1.2 主要试剂

TaKaRa RNA提取试剂盒、TaKaRa RNA反转录试剂盒、TaKaRa DNA纯化试剂盒、pMD19-T载体、2×PCR Master Mix及TaKaRa Taq酶等均购自宝生物工程（大连）有限公司;DH5α感受态细胞购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 RNA的提取及cDNA第1链的合成

将春尺蠖在-10、-5、0、5、25 ℃处理下的昆虫供试样本置于灭菌后的研钵中用液氮研磨，具体提取步骤参照TaKaRa RNA提取试剂盒说明书，而后用1.0%琼脂糖凝胶电泳和Nano PhotometerTMP-Class超微量分光光度计分别对提取得到的RNA质量和浓度进行检测，质检合格后反转录合成第1链cDNA。

1.4 春尺蠖AcinTret1和AcinTret1-like基因的克隆

基于笔者所在实验室前期已测春尺蠖幼虫在不同温度胁迫下的转录组数据，根据差异分析结果及基因功能注释信息，同时结合美国国立生物技术信息中心（NCBI）网站上的BlastP进行验证，从中筛选出具有完整编码序列（CDS）的Tret1、Tret1-like基因。以转录组数据库中获取的基因序列为依据，用Primer Premier 5.0软件在春尺蠖Tret1和Tret1-like基因外围设计PCR扩增引物，以在上述不同温度处理下进行PCR扩增所得产物条带中最亮的样品cDNA为模板，扩增2个基因的完整编码蛋白区。

春尺蠖Tret1扩增引物：Tret1-F，5′-TTTTGACGTTCCCTGACAAACTATT-3′;Tret1-R，5′-AGAGAATCAATACATTACATGCCTACA-3′。

春尺蠖Tret1-like扩增引物：Tret1-like-F，5′-ATGCGCCCACCTCGGTAGC-3′;Tret1-like-R，5′-ATTTTCCTATCACTTTTCTAAAAGCGA-3′。

PCR反应体系共25 μL（包括1 μL cDNA模板、各1 μL上下游引物、12.5 μL Master Mix，用RNase-free Water补至25 μL）。PCR反应条件：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，60 ℃（Tret1）/62 ℃（Tret1-like）30 s，72 ℃ 1 min，共30次循环;72 ℃ 10 min，4 ℃保存。用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测春尺蠖Tret1与Tret1-like基因的PCR扩增产物，产物经回收、亚克隆后送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.5 春尺蠖AcinTret1和AcinTret1-like基因的生物信息学分析

在NCBI ORF Finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）在线网站预测春尺蠖2条海藻糖转运蛋白对应基因的编码区序列。用DNAMAN软件对春尺蠖2条海藻糖转运蛋白的氨基酸序列与其他昆虫Tret1基因编码氨基酸序列的一致性进行分析;N端信号肽通过在线预测工具SignalIP 5.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）来预测;用TMHMM在线网站（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）对蛋白质的跨膜区域进行预测;利用MEGA 6.0软件中的邻接法（neighbor-joining，NJ）、p距离（P-distance）法，重复运行 1 000 次来构建系统发育树。

1.6 春尺蠖AcinTret1和AcinTret1-like基因的表达

为了解春尺蠖3龄幼虫在低温胁迫下的基因表达情况，对5个温度处理下的春尺蠖基因表达情况进行测定（每个温度处理设3个生物学重复，每个重复设20头试虫）。基因表达评估方法采用每1百万个map上的reads中map到外显子的每1 k个碱基上的reads个数（fragment per kilobase of transcript per million mapped reads，FKPM），这是转录组测序数据分析中常用的基因水平评估方法，能消除基因长度和测序量差异对计算基因表达的影响。本研究以AcinTret1和AcinTret1-like基因的FKPM值为基础，分析2个海藻糖转运蛋白基因的表达情况。

1.7 数据统计与分析

用SPSS 17.0软件的单因素方差分析中的Duncans多重比较分析对海藻糖转运蛋白的基因差异表达情况进行统计分析，用GraphPad Prism 7.0软件进行作图。数据结果以“平均值±标准误”的形式表示，显著性分析水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 春尺蠖AcinTret1和AcinTret1-like基因的克隆

根据转录组数据库中已有的春尺蠖AcinTret1和AcinTret1-like序列信息，分别在基因编码蛋白区设计引物以扩增目的基因序列，以AcinTret1的 F/R 和AcinTret1-like的F/R为引物在目的基因外围分别扩增2 126、1 767 bp长的片段，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，分别发现1条长度约为2 000、1 500 bp 的特异性单一亮带，经测序后发现这2条条带分别包含转录组数据中长度为1 926、1 533 bp的海藻糖转运蛋白基因序列，序列信息比对一致。将上述基因分别命名为AcinTret1和AcinTret1-like（GenBank登录号：MZ689788和MZ689789）。

2.2 AcinTret1和AcinTret1-like基因编码蛋白的生物信息学分析

春尺蠖AcinTret1和AcinTret1-like基因序列CDS全长分别为1 926、1 533 bp，分别编码641、510个氨基酸，蛋白质分子量分别为70.65、55.35 ku，等電点分别为9.33、8.86;AcinTret1、AcinTret1-like基因编码蛋白在N端均不含信号肽且均有12个跨膜区（图1-A、图1-B），表明二者均为跨膜蛋白。此外，2条海藻糖转运蛋白均具有MFS超家族的典型结构域（图2-A、图2-B），其中AcinTret1位于第168～615位氨基酸，AcinTret1-like则位于第108～501位氨基酸（图3-A、图3-B）。

2.3 春尺蠖海藻糖转运蛋白基因的同源性比对及系统进化关系分析

将春尺蠖AcinTret1和AcinTret1-like基因对应的氨基酸序列与NCBI中搜索到的其他鳞翅目昆虫的相应氨基酸序列进行比对，结果表明，Tret1与Tret1-like之间的一致性均≤25.59%，其中春尺蠖AcinTret1与AcinTret1-like基因对应的氨基酸序列之间的一致性最高，为25.59%。AcinTret1基因对应的氨基酸序列与同为尺蛾科的冬尺蠖（Operophtera brumata）的一致性最高，为80.43%，其次为与野桑蚕（Bombyx mandarina）、家蚕（Bombyx mori）的一致性，分别为75.58%和58.79%。AcinTret1-like基因对应的氨基酸序列与同为鳞翅目的粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）的一致性最高，为82.94%，其次为与棉铃虫（Helicoverpa armigera）和斜纹夜蛾（Spodoptera litura）的一致性，分别达到8157%和80.78%（图4）。

通过NCBI搜索其他昆虫已上传的Tret1基因对应的氨基酸序列与春尺蠖AcinTret1和AcinTret1-like基因对应的氨基酸序列，并构建系统进化树。结果显示，进化树中Tret1、Tret1-like基因对应的氨基酸序列分别聚在不同分支上;在Tret1-like基因对应

氨基酸序列的分支上，AcinTret1-like基因对应氨基酸序列与同为鳞翅目的粉纹夜蛾Tret1-like基因对应的氨基酸序列聚为一类，表明二者的亲缘关系最近，其次为棉铃虫和斜纹夜蛾，与鳞翅目螟蛾科大蜡螟（Galleria mellonella）间的亲缘关系最远;在AcinTret1分支上，AcinTret1与同为尺蛾科的冬尺蠖聚为一类，表明二者的亲缘关系最近，其次为蚕蛾科的野桑蚕和家蚕，与同翅目蚜科的豌豆芽（Acyrthosiphon pisum）和双翅目蚊科的埃及伊蚊（Aedes aegypti）的亲缘关系较远（图5）。

2.4 春尺蠖AcinTret1和AcinTret1-like基因在不同温度胁迫下的表达分析

从图6可以看出，AcinTret1和AcinTret1-like基因的表达量均在-10 ℃达到最大值， 其次为25 ℃，呈现先下降后上升的趋势，但AcinTret1基因在-5、0、5 ℃温度处理下的表达量差异不显著，而AcinTret1-like基因在所有温度处理下的表达量差异均显著（P<0.05）。

3 讨论

本研究从笔者所在实验室前期已测春尺蠖3龄幼虫在低温胁迫下的转录组数据中筛选出2个海藻糖转运蛋白编码基因（Tret1和Tret1-like），结合NCBI BlastP与RT-PCR技术，克隆获取了基因的完整编码蛋白区。经序列信息分析发现，2个海藻糖转运蛋白基因均包含MFS超家族的典型结构域，均未发现信号肽且均具有12个跨膜区。Saier研究结果表明，MFS超家族大多具有12个跨膜区，少数具有14个或24个跨膜区[12]。在褐飞虱中，NlTret1-like X1也存在12个跨膜区域，而NlTret1-2 X1却只有10个跨膜区，可能是由于该基因为非全长序列[13]。通过序列比对发现，春尺蠖Tret1、Tret1-like基因对应氨基酸序列与其他鳞翅目昆虫Tret1、Tret1-like对应氨基酸序列的一致性均在80%以上。系统进化结果显示，春尺蠖Tret1对应氨基酸序列与同为尺蛾科的冬尺蠖聚为一支，而Tret1-like对应氨基酸序列与同为鳞翅目昆虫的粉纹夜蛾聚为一支。通过生物信息学分析、同源序列比对和系统进化分析，进一步确认了这2个基因为春尺蠖海藻糖转运蛋白编码基因，并分别命名为AcinTret1和AcinTret1-like。

在昆虫千百年来的进化过程中，不同昆虫之间的Tret编码蛋白具有相似的保守结构域，这些保守结构域与葡萄糖转运蛋白超家族有很多相似之处，在对嗜眠摇蚊（Polypedilum vanderplanki）的研究中发现，Tret1编码蛋白具有转运多种物质的能力，对海藻糖和葡萄糖类似物均有转运作用[9]，因此有研究推测Tret1编码蛋白可能是葡萄糖转运蛋白超家族的新成员[14]。基因的序列相似性出现在包括Tret1在内的所有葡萄糖转运蛋白（glucose transporter，Glut）超家族成员，但它们在底物选择性和动力学等生化特性方面却存在很大差异，如Glut1和Glut5的底物就完全不同[15]，说明除了保守区域中的氨基酸残基外，其他氨基酸残基也可能对每个转运蛋白的特异性产生影响。在大猿叶虫（Colaphellus bowringi）中发现2个Tret1，其表达有组织特异性，同时发现其在不同组织间可能发挥着不同功能。此外，於卫东等推测，在褐飞虱体内的2个Tret1在不同组织间也可能发挥着不同功能[13，16]。本研究中，AcinTret1与AcinTret1-like对应的氨基酸序列在保守结构域5′端上相差100个左右的氨基酸序列，可能是导致二者抵御低温胁迫时存在一定差异的原因，其表达可能也存在组织特异性，有待进一步研究。

从春尺蠖与其他鳞翅目昆虫的系统进化结果可以看出，春尺蠖Tret1、Tret1-like基因对应氨基酸序列分别与其他昆虫的AcinTret1-like和Tret1-like基因对应氨基酸序列聚为一类，同时与亲缘关系更近的同科昆虫聚在同一分支上，表明春尺蠖这2个海藻糖转运蛋白与其他鳞翅目昆虫有较高的同源性，在褐飞虱上也得出了相同的结论[13]，系统进化结果与序列分析结果一致。

海藻糖是昆虫中主要的血糖，而海藻糖转运蛋白则负责海藻糖的运输并调节海藻糖在不同组织中的分布，在昆虫的营养稳态和胁迫耐受性中起着重要作用[1-5，17]。在褐飞虱中，通过干扰褐飞虱NlTret1-like X1，可使体内TPS和TRE均呈现低表达[13]。由以上结果可以看出，Tret的表达量与TPS和TRE的表达量呈现相同趋势。沙葱萤叶甲（Galeruca daurica）GdTPS易受低温诱导，随着温度的降低，其表达量逐漸升高[18]。在本研究中，AcinTret1、AcinTret1-like在-10、25 ℃温度高表达，而在其他温度（-5、0、5 ℃）下低表达，可能是由于春尺蠖海藻糖转运蛋白在未进行低温处理前处于（22±1） ℃环境下，此时昆虫体内的海藻糖用来维持正常的生理功能，当温度降低至5、0、-5 ℃时，体内海藻糖足够用来抵御外界低温，所以不需要再运输更多海藻糖;当温度降低到-10 ℃时，海藻糖转运蛋白才再度生成用来运输更多的海藻糖以抵御低温。

4 结论

本研究从春尺蠖幼虫不同温度胁迫下的转录组中克隆获取AcinTret1和AcinTret1-like，基因序列cDNA全长分别为1 926、1 533 bp，分别编码641、510个氨基酸，均不含信号肽，同时均具有12个跨膜区。从系统进化结果可以看出，春尺蠖AcinTret1与同为鳞翅目尺蛾科的冬尺蠖亲缘关系最近，Tret1-like则与同为鳞翅目的粉纹夜蛾亲缘关系最近，以上结果进一步确定了AcinTret1和AcinTret1-like编码海藻糖转运蛋白。基因表达分析结果显示，AcinTret1和AcinTret1-like基因的表达量均在 -10 ℃ 达到最大值，其次为25 ℃，呈现先下降后上升的趋势，说明春尺蠖Tret1可受低温诱导，可能在低温胁迫中起作用。研究结果有助于揭示春尺蠖低温胁迫下海藻糖代谢机制，可为其在低温胁迫下的调控机制奠定基础。

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