加味丹玄口康调控口腔黏膜下纤维化大鼠Wnt/β-catenin信号通路机制研究

王宗康，肖艳波，刘 寻，谭怡丝，谭 劲

(湖南中医药大学第一附属医院口腔科，湖南 长沙 410007)

口腔黏膜下纤维化，又称口腔黏膜纤维性变(Oral submucous fibrosis，OSF)，是一种慢性进行性的口腔黏膜下疾病，临床表现为口干、烧灼痛和张口受限等，好发于咀嚼槟榔的人群，且存在明显的癌变倾向[1-2]。中医学认为，长期咀嚼槟榔致邪毒入侵机体，再加患者自身正气亏损、痼结痰瘀，导致OSF的发病，因此治疗应以益气、活血、祛痰、解毒为主[3]。加味丹玄口康是基于桃红四物汤加减而成的中药复方制剂，可切实针对毒侵、痰结、气虚、血瘀等病机，达到标本兼治、恢复病损之目的。因此，本研究拟建立OSF模型大鼠，采用加味丹玄口康汤剂灌胃治疗，探究加味丹玄口康对OSF模型大鼠Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：35只SPF级成年雄鼠，购买于湖南斯莱克景达实验动物有限公司[动物许可证号(湘)20190004]，饲养温度23～25 ℃，相对湿度30%～35%，每日予12 h光照，按照以上条件饲养大鼠1周后进行实验。本研究经湖南中医药大学第一附属医院伦理委员会批准。

1.1.2 实验药物与试剂：Wnt抑制剂(KYA1797K，美国Selleck公司)；异氟烷(瑞沃德生命科技有限公司)；槟榔提取物(成都德斯特生物公司)；水合氯醛(士锋生物科技有限公司)。逆转录试剂盒(批号CW2569，北京康为世纪公司)；Power SYBR Green PCR Master Mix试剂盒(批号QPK-201，日本TOY-OBO公司)；Wnt-1抗体(批号ab15251，英国Abcam公司)；β连环蛋白(β-catenin)抗体(批号ab32572，英国Abcam公司)；轴抑制因子2(Axin2)抗体(批号ab32197，英国Abcam公司)；细胞周期蛋白D1(Cylin D1)抗体(批号ab251892，英国Abcam公司)；显液(批号23423，Cyanagen公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 加味丹玄口康：由丹参、玄参、当归、生地黄、白花蛇舌草、生黄芪、薄荷、桔梗、夏枯草、茵陈、白芍各10 g，红花5 g组成。以上中药均购自湖南省中医药大学第一附属医院门诊中药房，中药中加入500 ml温开水，水煎浓缩至生药浓度为0.23 g/ml。

1.2.2 建模、分组与给药：在35只SPF级成年雄鼠中随机挑选5只大鼠作为正常组，剩余30只大鼠首先采用水合氯醛麻醉，随后予100 μl槟榔提取物(1 mg/ml)注射至大鼠两侧颊黏膜下进行建模，1次/d，持续注射8周。以大鼠口腔黏膜颜色发白、质地变硬并形成条索状，张口明显受限为口腔黏膜纤维化建模成功标志，最终成功建模25只OSF模型大鼠。将25只OSF模型大鼠随机分为OSF模型组、加味丹玄口康低剂量组、加味丹玄口康中剂量组、加味丹玄口康高剂量组和Wnt抑制剂组，每组各5只。加味丹玄口康低剂量组、加味丹玄口康中剂量组、加味丹玄口康高剂量组大鼠分别给予4、8、12 ml/kg加味丹玄口康灌胃，Wnt抑制剂组大鼠给予25 mg/kg的KYA1797K腹腔注射，OSF模型组和正常组大鼠给予4 ml/kg的0.9%氯化钠溶液灌胃。各组均1次/d，持续给药4周。

1.2.3 检测大鼠张口度：分别在治疗前、治疗2周、治疗4周观察大鼠张口度。在麻醉状态下，固定大鼠的上中切牙，利用计力器给予大鼠下中切牙2 N的力，充分打开口腔，随后采用游标卡尺测量上、下、中切牙的距离，重复测量3次，取其平均值。

1.2.4 评估颊黏膜评分：分别在治疗前、治疗2周、治疗4周评估大鼠颊黏膜评分。对大鼠颊黏膜的病变程度进行分级，包括口腔黏膜的色泽、光滑程度和纤维条索等三方面，总分为0～3分，病变完全消失则为0分，得分越高，病变越重。

1.2.5 PCR检测Wnt-1、β-catenin、Cylin D1、Axin mRNA水平：取大鼠颊黏膜组织与1 ml的Trizol混合研磨呈粉末状，提取颊黏膜组织总RNA，并检测RNA的含量和纯度，随后采用Takara逆转录试剂盒对上述总RNA进行逆转录处理，获得cDNA。将cDNA与Wnt-1、β-catenin、Cylin D1和Axin等基因的上下游引物一同进行基因扩增。PCR反应体系(20 μl)：1 μl的cDNA模板、10 μl的12×Real-time PCR Mix/2×PCR Mix、1 μl上下游引物、7 μl RNase H2O。PCR反应条件：预变性94 ℃，4 min；94 ℃，40 s；60 ℃，30 s，循环40次，75 ℃，5 min，4 ℃，循环40次。采用2-△△Ct方法计算Wnt-1、β-catenin、Cylin D1和Axin等基因表达量。Wnt-1引物：上游引物5’-CGAAACCGCCGCTGGAACTG-3’，下游引物5’-CGGAGGTGATTGCGAAGATAAAC-3’，片段长度103bp。β-catenin引物：上游引物5’-GGAGGAGATAGTTGAAGGG-3’，下游引物5’-CACAAACAGTGGAATGGTA-3’，片段长度106bp。Cylin D1引物：上游引物5’-GCAAGCACCCGCAAACCT-3’，下游引物5’-AGCTCGGTCAGGGCATCG-3’，片段长度160bp。Axin引物：上游引物5’-ACCGAAATACATTCTTATAAC-3’，下游引物5’-TCCATACCTAACTCTCTC-3’，片段长度450bp。

1.2.6 Western blot法检测Wnt-1、β-catenin、Cylin D1、Axin蛋白水平：取大鼠颊黏膜组织，磨碎后与60 μl的裂解液混合，提取总蛋白；离心，取上清液，采用BCA蛋白浓度试剂盒测量蛋白浓度；随后加入蛋白上样缓冲液，在100 ℃下水浴加热，持续5 min；最后依据蛋白质分子量配制凝胶、电泳、转膜、孵抗体、显色，并读取条带灰度值。

2 结 果

2.1 各组大鼠治疗前后张口度和颊黏膜评分比较 见表1。治疗前，OSF模型组、Wnt抑制剂组、加味丹玄口康低剂量组、加味丹玄口康中剂量组、加味丹玄口康高剂量组大鼠的张口度和颊黏膜评分比较，差异无统计学意义(均P>0.05)，且以上各组大鼠张口度均小于正常组，颊黏膜评分均高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)。治疗2周及治疗4周后，Wnt抑制剂组、加味丹玄口康中剂量组、加味丹玄口康高剂量组大鼠的张口度增大，颊黏膜评分减小，加味丹玄口康高剂量组大鼠的张口度最大、颊黏膜评分最低，组间比较差异有统计学意义(均P<0.05)；且以上各组大鼠张口度和颊黏膜评分与正常组比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。

表1 各组大鼠治疗前后张口度、颊黏膜评分比较

2.2 各组大鼠口腔黏膜组织Wnt-1、β-catenin、Cylin D1、Axin mRNA表达比较 见表2。干预后，OSF模型组、加味丹玄口康低剂量组、加味丹玄口康中剂量组Wnt-1、β-catenin、Cylin D1 mRNA表达水平均高于加味丹玄口康高剂量组和正常组，Axin mRNA表达低于加味单玄口康高剂量组和正常组，差异有统计学意义(P<0.05)。Wnt抑制剂组Wnt-1、β-catenin、Cylin D1 mRNA的表达高于加味丹玄口康高剂量组，Axin mRNA表达低于加味丹玄口康高剂量组，差异有统计学意义(均P<0.05)。加味丹玄口康高剂量组Wnt-1、β-catenin、Cylin D1、Axin mRNA的表达与正常组比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。

表2 各组大鼠口腔黏膜组织Wnt-1、β-catenin、Cylin D1、Axin mRNA表达比较

2.3 各组大鼠口腔黏膜组织Wnt-1、β-catenin、Cylin D1、Axin蛋白表达比较 干预后，OSF模型组、加味丹玄口康低剂量组、加味丹玄口康中剂量组Wnt-1、β-catenin、Cylin D1蛋白表达高于加味丹玄口康高剂量组和正常组，Axin蛋白表达低于加味丹玄口康高剂量组和正常组，差异有统计学意义(P<0.05)。Wnt抑制剂组Wnt-1、β-catenin、Cylin D1蛋白的表达高于加味丹玄口康高剂量组，Axin蛋白表达低于加味丹玄口康高剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)。加味丹玄口康高剂量组Wnt-1、β-catenin、Cylin D1、Axin蛋白的表达水平与正常组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组大鼠口腔黏膜组织Wnt-1、β-catenin、Cylin D1、Axin蛋白表达比较

3 讨 论

近年来，多种中药、中成药和方剂被广泛应用于临床，且取得较好疗效。有研究证实，中医药可有效治疗口腔疾病，延缓OSF的进展，其中丹参、芦苇等天然药物，归红注射液、复方丹参滴丸等中成药，玉泉汤、桃红四物汤等方剂，均可有效缓解OSF的临床症状[4-6]。OSF的癌变涉及多个信号传导通路，目前研究较为广泛的是Wnt/β-catenin信号通路。Wnt/β-catenin信号通路涉及多个分子如Wnt-1、β-catenin、Cylin D1和Axin等，不同信号分子相互作用、相互制约，共同调控细胞的增殖和分化[7]。Wnt-1是Wnt/β-catenin信号通路的初始信号分子，其表达增加有助于Wnt/β-catenin信号通路下游信号的激活。Wnt-1蛋白可抑制胞浆内β-catenin蛋白的降解，过表达的β-catenin蛋白可进入核内与转录因子结合，促进口腔黏膜上皮细胞向成纤维细胞转化[8]。Cylin D1蛋白是一种细胞G1/S期特异性周期蛋白，可促进原有成纤维细胞的增殖，最终导致OSF恶变[9-10]。在正常情况下，Axin主要是与其他蛋白结合形成复合体，促使β-catenin蛋白磷酸化而被降解；Wnt-1蛋白可阻碍Axin蛋白复合体的形成，抑制胞浆内β-catenin蛋白的降解[11-12]。本研究显示，加味丹玄口康高剂量组疗效优于Wnt抑制剂组。

加味丹玄口康中丹参、当归、红花可活血通络，散瘀止痛，促进血液循环[13]；生黄芪、白芍可补气固表，提高机体免疫力[14]；白花蛇舌草、夏枯草可清热解毒，软坚散结；薄荷疏风散热；桔梗祛痰排脓；生地黄、玄参、茵陈可清热生津，滋阴养血[15-18]。全方共奏活血解毒化瘀、扶正祛邪之功，方中活血化瘀药能促进血液循环、改善血液髙黏滞状态，且与扶正祛邪药联用，可提高机体免疫力，促进OSF模型大鼠恢复[19]。

本研究结果显示，与OSF模型组大鼠比较，加味丹玄口康高剂量组Wnt-1、β-catenin、Cylin D1 mRNA和蛋白表达水平均降低，Axin mRNA和蛋白表达水平均增高，且在治疗第4周，加味丹玄口康高剂量组大鼠与正常组张口度、颊黏膜评分比较无统计学差异，提示加味丹玄口康通过调节Wnt/β-catenin信号通路，逆转大鼠口腔黏膜纤维化，这与谢赛飞等[20]研究结果一致。但是，加味丹玄口康对Wnt/β-catenin信号通路具体调节起始环节和机制尚未完全明确，有待进一步研究。

综上所述，加味丹玄口康可有效改善OSF模型大鼠的临床症状，通过抑制Wnt/β-catenin信号通路相关基因及蛋白的表达，抑制大鼠口腔黏膜纤维化。