当归多糖通过Wnt/β-catenin信号通路抑制骨关节炎软骨细胞氧化应激损伤与炎症反应

徐 翀，申利民，苑文杰

(1.保定市第二医院骨科，河北 保定 071051；2.安国市中医院骨科，河北 保定 071200)

骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是临床上常见的退行性疾病，以行动受限及关节疼痛为主要临床症状，由于关节软骨纤维化、软骨下骨增生形成骨赘所导致[1]。骨关节炎在中医学中归属于“骨痹”范畴，多由年老体衰及肝肾亏虚，机体在感受外邪情况下发病[2]。中医治疗骨关节炎具有丰富临床经验，多采用外治法与内治法联合应用，内治法以口服中药汤剂为主，外治法包括推拿、针灸等[3]。当归是传统的中药草本植物，研究证实当归在体内外均具有抗氧化和抗炎作用，当归中主要活性成分当归多糖对活性氧的产生具有抑制作用，且可调控氧化应激反应，进而起到抗氧化作用，推测其可以抑制骨关节炎软骨细胞的氧化应激损伤和炎症反应[4]。Wnt/β-catenin信号通路是骨关节炎中经典的信号通路，它参与白细胞介素(Interleukin-1β，IL-1β)诱导的软骨降解过程。但是当归多糖对炎症反应、氧化应激反应的抑制作用是否与该通路有关尚未有相关报道。本研究通过建立SD大鼠OA模型，观察当归多糖对OA模型大鼠中炎症反应、氧化应激反应的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：选取45～60 d的无特定病原体的远交群大鼠，简称为SD大鼠，共30只。

1.1.2 实验药物与试剂：当归多糖ASP(批号20200916，上海一林生物科技有限公司)；SW1353细胞(批号20200801，美国ATCC公司)；胎牛血清(批号20200902，美国Gibco公司)；羟乙基哌嗪乙硫磺酸(批号20200721，美国Gibco公司)；0.25%胰蛋白酶(批号20200812，美国Gibco公司)；培养基(批号20200528，美国Gibco公司)；过氧化氢酶(批号20200827，上海碧云天生物技术有限公司)；超氧化物歧化酶(批号20200925，上海碧云天生物技术有限公司)；丙二醛(批号20190822，上海碧云天生物技术有限公司)；TNF-α(批号20201102，上海碧云天生物技术有限公司)；IL-β(批号20201011，上海碧云天生物技术有限公司)；碘乙酸(批号20200725，浙江海川化学品有限公司)；一抗、二抗(批号20201102、20201109，美国Abcam公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 OA模型的构建与分组：健康大鼠6只作为对照组。将大鼠称重后麻醉，采用仰卧位固定，将右侧膝关节处毛发剪去，消毒，OA组注射MIA，对照组用等量0.9%氯化钠溶液代替。分组：造模3 d后，将造模成功的大鼠随机分为模型组、不同浓度的当归多糖溶液组(0.5、1、2 g/kg)，每组各6只，然后给药，1次/d。给药21 d后，从眼眶取血，并将大鼠处死，打开右侧膝关节，收集软骨并冻存于液氮中备用。

1.2.2 采用酶联免疫吸附法测定各组大鼠血浆参数：主要检测过氧化物氢化酶(Catalase，CAT)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、TNF-α以及IL-β的浓度。

1.2.3 测定各组大鼠软骨组织MMP-13 mRNA和c-Fos蛋白表达水平：各基因引物序列，见表1。

表1 引物序列

1.2.4 IL-1β模型中当归多糖对SW1353细胞活性的影响：SW1353是建立骨关节炎模型常用的细胞系。取SW1353细胞，将其接种到孔板中后转移至培养箱中进行240 min周期培养。在培养过程中，将SW1353细胞样品进行随机分类，并分别向对照组、当归多糖组的培养基中加入不同的药剂，其中对照组予FBS RPMI 1640培养基，当归多糖组使用不同浓度的当归多糖试剂。培养2 d，分别向模型组、当归多糖组的培养基中加入200 ng/ml的IL-1β，对照组的培养基中则无试剂加入，之后将各组样品放入培养室中继续培养一段时间，并放入震荡设备中进行震荡，外界温度保持不变的情况下，使用酶标仪测定细胞增值率。细胞增殖率=用药组与模型组的光密度值之差/对照组与模型组的光密度之差。

1.2.5 IL-1β模型中当归多糖保护SW1353细胞的分子机制：取出SW1353细胞样品，将其接种到孔板中后，转移至培养箱中培养1 d。当归多糖组加入不同浓度(10、50、100 μg/ml)的当归多糖，对照组用RPMI 1640培养基代替，于细胞培养箱中继续培养48 h。48 h后，在模型组、当归多糖组中加入20 ng/ml的IL-1β溶液，继续培养8 h。孔板底部细胞加Trizol裂解后提取总RNA，反转录成cDNA，采用RT-PCR检测细胞MMP-13、GSK-3β、Wnt 4a、ADAMTS4、β-catenin mRNA表达水平。采用Western blot法检测β-catenin和MMP-13的蛋白表达。结果以相对表达定量2-△△Ct表示。细胞培养结束后，收集细胞，裂解后等量蛋白上样，然后进行SDS-PAGE电泳，转模、封闭、分别与一抗和二抗杂交，通过凝胶成像系统拍照和分析。

2 结 果

2.1 各组大鼠组织病理学形态观察 各浓度当归多糖组给药21 d后，解剖大鼠关节腔进行观察。对照组大鼠关节腔中无积液，滑膜正常，关节软骨光滑明亮；模型组关节腔中出现大量的积液，而且滑膜组织出现充血、肿大以及增生等现象，关节软骨组织比较暗淡，其表面出现凹凸不平甚至深的凹坑，同时软骨组织出现损伤；与模型组比较，当归多糖中剂量组、当归多糖低剂量组大鼠关节腔中积液减少，软骨灰暗、粗糙，表面有裂隙，无软骨缺损；当归多糖高剂量组大鼠的关节腔无明显积液，部分滑膜增生，软骨没有明显损伤。见图1。

图1 各组大鼠关节腔病理学形态图

2.2 各组大鼠IL-1β、TNF-α水平比较 模型组大鼠IL-1β和TNF-α表达水平均高于对照组；不同剂量当归多糖组IL-1β和TNF-α水平均低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠IL-1β、TNF-α水平比较(pg/ml)

2.3 各组大鼠MDA、SOD、CAT水平比较 见表3。模型组大鼠MDA蛋白水平均高于对照组，SOD、CAT蛋白水平均低于对照组(P<0.05)。不同剂量当归多糖组MDA蛋白水平均低于模型组，SOD、CAT蛋白均高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。2 g/kg当归多糖组MDA蛋白均低于0.5 g/kg当归多糖组和1 g/kg当归多糖组，SOD、CAT蛋白均高于0.5 g/kg当归多糖组和1 g/kg当归多糖组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 各组大鼠MDA、SOD、CAT水平比较(U/mg)

2.4 各组大鼠软骨组织MMP-13 mRNA和c-Fos蛋白表达比较 见表4(图2)。模型组大鼠MMP-13 mRNA和c-Fos蛋白表达均高于对照组；不同剂量当归多糖组MMP-13 mRNA和c-Fos蛋白均低于模型组，其中2 g/kg当归多糖组MMP-13 mRNA和c-Fos蛋白水平最低，差异有统计学意义(均P<0.05)。

表4 各组大鼠软骨组织MMP-13 mRNA和c-Fos蛋白表达比较

A：对照组；B：模型组；C：0.5 g/kg当归多糖组；D：1 g/kg当归多糖组；E：2 g/kg当归多糖组

2.5 各组大鼠SW1353细胞活性比较 模型组大鼠细胞活性低于对照组(P<0.05)，不同剂量当归多糖组大鼠细胞活性均高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 各组大鼠SW1353细胞活性比较(%)

2.6 各组大鼠Wnt 4a mRNA、β-catenin、GSK-3β mRNA比较 见表6。模型组大鼠Wnt 4a mRNA、β-catenin、GSK-3β mRNA均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。0.5 g/kg当归多糖组、1 g/kg当归多糖组、2 g/kg当归多糖组大鼠Wnt 4a mRNA、β-catenin、GSK-3β mRNA水平均低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。不同剂量当归多糖组与对照组比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。

表6 各组大鼠Wnt 4a mRNA、β-catenin、GSK-3β mRNA水平比较

2.7 各组大鼠ADAMTS4 mRNA和MMP-13蛋白表达比较 见表7(图3)。模型组大鼠的ADAMTS4 mRNA和MMP-13蛋白表达均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，不同剂量当归多糖组大鼠的ADAMTS4 mRNA和MMP-13蛋白表达均高，差异有统计学意义(P<0.05)。

表7 各组大鼠ADAMTS4 mRNA和MMP-13蛋白表达比较

A：对照组；B：模型组；C：0.5 g/kg当归多糖组；D：1 g/kg当归多糖组；E：2 g/kg当归多糖组

3 讨 论

骨关节炎在中医学中的病机为虚实两端，即因虚致病和因病致虚，表现为关节疼痛、局部肿胀及屈伸功能受限，中医认为骨关节炎发病的病机为本虚标实[5]，对于不通则痛者给予散寒祛湿、活血化瘀治疗，通痹止痛，疏通经络；对于不荣则痛者给予调养气血，滋补肝肾治疗[6]。多项临床研究发现，骨关节炎患者的IL-1β表达水平明显高于常人[7-8]。IL-1β通过与目标细胞上的受体结合而传递信息至细胞内，进而对关节软骨细胞生理功能产生干扰，IL-1β可以通过激活单核巨噬细胞，引发机体炎症反应[9]。TNF主要分泌于单核巨噬细胞，是一种单核因子，与IL-1在体内的分布相似，TNF在OA患者中水平较高[10]。IL-1β、TNF-α在OA疾病发生发展过程中均有重要意义[11]。本研究结果显示，给予当归多糖治疗后，大鼠IL-1β、TNF-α水平均降低，且具有一定剂量依赖性。当归入肝、脾、心经，味甘、温、辛，有补血活血、润燥滑肠及调经止痛的功效，可缓解骨关节炎疼痛及肿胀。当归多糖是当归水溶性成分，可改善免疫力，抑制炎症反应[12]。

氧化应激反应对骨关节疾病的产生和发展也有一定影响[13]。氧化应激反应的水平高低反映骨关节细胞损伤程度[14]。CAT、SOD是抗氧化酶，可有效反映机体氧化应激反应程度，阻止氧化应激对组织细胞的损害[15]。SOD是体内广泛存在的金属酶，可以清除生物体内的超氧自由基，起到机体自我保护的作用，在机体免疫系统中具有重要作用[16]。CAT是一种可以清除H2O2的酶，是免疫系统的重要酶[17]。以往研究显示，当归多糖对CCL4造成的肝细胞损伤具有一定抑制作用，可降低MDA水平，维持正常水平。本研究结果显示，当归多糖处理后，MDA表达降低，SOD和CAT水平显著增加，提示当归多糖具有明显抗氧化应激作用，当归多糖可抑制骨关节炎软骨细胞的氧化应激反应。有研究证实，当归多糖通过抑制肝细胞的脂质过氧化反应，维持生物细胞膜稳定性，抑制肝细胞的变形及坏死进程，恢复肝细胞功能，抑制SOD和MDA产生，起到抗氧化、清除自由基作用[18]。

MMP在各种结缔组织中广泛存在，是OA关节软骨破坏的重要调控因子之一，正常情况下关节软骨分泌的MMP较少，OA患者关节软骨中表达水平增加，可引起关节软骨退变[19]。有研究显示，当归多糖具有抑制炎症反应、氧化应激反应的作用，改善细胞功能，促进受损软骨细胞恢复，抑制MMP-13基因表达[20]，这与本研究结果相符。本研究显示，当归多糖处理后MMP-13和cFos表达降低。

本研究采用IL-1β体外损伤模型研究当归多糖在OA治疗中抗氧化应激、抗炎症反应的分子机制。结果发现，当归多糖可以有效降低IL-1β对软骨细胞的损伤，增加软骨细胞活性，且当归多糖可降低β-catenin、Wnt 4a、GSK-3β、MMP-13、ADAMTS4表达水平，抑制IL-1β引起的软骨降解，缓解患者症状，提示当归多糖通过Wnt/β-catenin信号通路抑制骨关节炎软骨细胞氧化应激损伤与炎症反应。