灵芝菌丝体水溶性抗氧化活性成分的多指标提取工艺优化

郑丹婷,陈炼茹,韩 伟,冯 杰,唐庆九,张劲松,冯 娜

(1.华东理工大学 药学院 制药工程与过程化学教育部工程研究中心 上海市新药设计重点实验室,上海 200237;2.上海市农业科学院 食用菌研究所 国家食用菌工程技术研究中心,上海 201403)

灵芝是应用最广泛的药用真菌之一,与鹿茸、人参、首乌并列为我国四大珍贵药材。大量的研究表明灵芝具有抗肿瘤、抗炎、调节免疫、降血脂、抗氧化和保护神经等药理活性[1-5],故具有极高的市场需求。传统意义上的灵芝为多孔菌科真菌赤芝或紫芝的子实体[6],其受地域、季节、原料等因素的影响,品控较差、生长周期长且成本较高[7],使灵芝的商业化应用受限。灵芝菌丝体为灵芝营养体的基本结构,可通过液态发酵技术快速获得,且可以通过对培养条件的调整,得到含有更多目标成分(如三萜、多糖、氨基酸等)的菌丝体[8-10],有利于灵芝有效成分工业化生产的规模化与标准化。因此对灵芝菌丝体的研究具有重要价值。

天然产物的体外抗氧化研究有很多,但目前尚无标准化的评价方法,且由于抗氧化机制较为复杂,通常选取多种方法进行评价,因此需要利用多指标综合分析方法将不同评价方法得到的结果进行整合。按权重计算法可将多指标综合分析方法分为主观法和客观法两类[11]。熵权法是根据不同评价指标各自区分度的大小进行加权的一种客观方法,通过该法确定指标权重的评价结果具有很强的数学理论依据,避免了主观判断存在的不合理性,真正做到了符合客观实际的权重计算[12],且计算方式简单、可操作性强,有利于对多种方法得到的结果进行综合评价。

本文以灵芝菌丝体为原材料,对其水溶性抗氧化活性成分进行提取,采用熵权法对灵芝菌丝体水提液(GLMw)的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除率、2,2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)自由基清除率、羟自由基清除率进行赋权。以加权得到的灵芝菌丝体水提液综合抗氧化活性为评价指标,在单因素实验的基础上应用星点设计-效应面优化法(CCD)对灵芝菌丝体水溶性抗氧化成分的超声提取工艺进行优化,为后续灵芝菌丝体抗氧化活性的进一步研究提供依据。

1 实验

1.1 主要原料与仪器

灵芝菌丝体样品由上海市农科院食用菌所提供。

乙醇,体积分数为95%,分析纯(AR),上海泰坦科技股份有限公司;2,2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS),质量分数>95%,上海毕得医药科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH),质量分数为96%,上海源叶生物科技有限公司;水杨酸、过硫酸钾、30% H2O2、NaH2PO4、Na2HPO4、NaOH和FeSO4·7H2O,皆为AR,上海凌峰化学试剂公司。

功率可调台式加热系列(LCD)超声仪(SK5210HP型),上海科导超声仪器有限公司;紫外-可见光分光光度计(UV1900PC型),上海亚研电子科技有限公司;台式微量高速离心机(H1650-W型),湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;水浴锅(SB-2000型),上海爱朗仪器有限公司;电子式内校分析天平(AL104型),梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;pH计(PHS-25型),上海仪电科学仪器。

1.2 样品溶液的制备

由于从灵芝菌丝体中提取得到的物质为混合物,为使不同提取条件下得到的样品溶液的体外抗氧化活性具有比较意义,参考蔡梦婷等[13]的表述方法,将各水提液稀释为2 mg/mL的样品溶液(即每mL样品溶液中含有从2 mg灵芝菌丝体粉末中得到的水提物),用于后续体外抗氧化活性测定。具体制备过程如下:精密称取灵芝菌丝体粉末0.1 g于具塞试管中,按一定液固比加入去离子水,浸润5 min后在相应条件(液固比、超声功率、超声时间、超声温度)下进行提取,提取后于11 000 r/min条件下离心12 min,取适量上清液定容于25 mL容量瓶,得2 mg/mL的样品溶液。

1.3 分析方法的确定

1.3.1 DPPH自由基清除率

参考Brand-Williams等[14]的方法,称取DPPH粉末12.5 mg,用乙醇(体积分数为95%)溶解,定容至100 mL,将所得0.031 7 mmol/L的DPPH自由基储备液避光保存。使用时稀释5倍,使其吸光度为0.7左右,得到DPPH自由基工作溶液。测量时,取样品溶液2 mL于5 mL棕色容量瓶,加入2 mL DPPH自由基工作溶液后摇匀,避光反应30 min后用紫外-可见光分光光度计于517 nm处测定吸光度,用95%乙醇调零。按式(1)计算DPPH自由基清除率(S1),重复实验3次,取平均值。

(1)

式中:Ai为样品溶液与DPPH溶液反应后的吸光度;Aj为用95%乙醇代替DPPH溶液测得样品溶液的本底吸光度;A0为以去离子水代替样品溶液的空白吸光度。

1.3.2 羟自由基清除率

采用水杨酸法测定水提液的羟自由基清除率,参考文献[15]并加以改进。在10 mL具塞试管中依次加入样品溶液、9 mmol/L FeSO4和8.8 mmol/L H2O2溶液各1 mL,室温下静置10 min,再向试管中移入1 mL 9 mmol/L水杨酸乙醇溶液,混合均匀后在37 ℃水浴条件下保温30 min,离心后检测上清液在510 nm处的吸光度,用去离子水调零。羟自由基清除率(S2)计算方法如式(2),重复实验3次,取平均值。

(2)

式中:A′i为样品溶液与水杨酸溶液反应后的吸光度;A′j为用去离子水代替H2O2测得样品溶液的本底吸光度;A′0为以去离子水代替样品溶液的空白吸光度。

1.3.3 ABTS自由基清除率

参考Ilyasov等[16]的方法并加以改进。移取5 mL 7 mmol/L ABTS溶液和100 μL 140 mmol/L过硫酸钾溶液于10 mL棕色容量瓶,摇匀后避光反应12～16 h,用pH=7.4的磷酸盐缓冲液稀释90倍左右,使其吸光度约为0.7,得到ABTS自由基工作溶液。取样品溶液1 mL于5 mL棕色容量瓶,加入4 mL ABTS自由基工作溶液后摇匀,避光反应6 min后测定溶液在734 nm的吸光度。按式(3)计算ABTS自由基清除率(S3),重复实验3次,取平均值。

(3)

式中:A″i为样品溶液与ABTS溶液反应后的吸光度;A″j为用磷酸盐缓冲液代替ABTS溶液测得样品溶液的本底吸光度;A″0为以去离子水代替样品溶液的空白吸光度。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 液固比的影响

在超声时间60 min、超声温度40 ℃、超声功率180 W条件下,考察液固比对灵芝菌丝体水提液抗氧化活性的影响,结果见图1。由图1可知:随液固比增大,3种自由基清除率的变化规律基本一致。液固比<50 mL/g时,随着液固比的增大,3种自由基清除率均增大,其中20～30 mL/g时清除率增大速度较快,这是由于当液固比<30 mL/g时,样品与溶剂间的浓度差较小,不利于抗氧化活性物质的溶解、扩散。液固比>30 mL/g时,水提液的自由基清除率随液固比的增大略有增大,到50 mL/g时达到最大值,60 mL/g后有所下降,但整体波动不大,其原因是液固比为50 mL/g时,样品的溶解达到饱和,此后继续增大液固比不但效果不明显,反而会增加热负荷并导致转移时的损失增加[17]。因此,液固比选择50 mL/g为最佳。

图1 不同液固比下的水提液抗氧化活性Fig.1 Effects of liquid-solid ratio on antioxidant activity of GLMw

图2 不同超声功率下水提液的抗氧化活性Fig.2 Effects of ultrasonic power on antioxidant activity of GLMw

2.1.2 超声功率的影响

通常来说,超声功率的增大有利于增强空化作用、提高破壁速率,从而导致更多活性物质的溶出,但随着超声功率的不断升高,一些成分可能会发生分解,从而影响提取物的抗氧化活性。王小梅等[18]通过研究发现不同超声功率下得到的麦冬多糖的分子量分布有较大差异,而不同分子量多糖的抗氧化活性也具有较大差异。因此,在超声温度40 ℃、超声时间60 min、液固比50 mL/g的条件下,考察超声功率对水提液抗氧化活性的影响,结果见图2。由图2可知:随超声功率增大,灵芝菌丝体水提液3种自由基清除率变化趋势基本一致,即超声功率为72～153W时,水提液的抗氧化活性随超声功率的增大而增大,超声功率为180 W时,抗氧化活性急剧下降。因此,选择153 W为最佳超声功率。

2.1.3 超声时间的影响

在液固比50 mL/g、超声功率153 W、超声温度40 ℃的条件下,考察超声时间对灵芝菌丝体水提液抗氧化活性的影响,结果见图3。由图3可知:随着超声时间的延长,水提液的抗氧化活性也不断增大,60 min时达到最高;超声时间超过60 min后,由于样品在溶剂中的浸提时间过长,其中的多糖等黏性物质会扩散出来并附着在样品表面,从而阻碍有效成分的提取,导致抗氧化活性有所下降,其中羟自由基清除率的下降幅度最大,但3种自由基清除率随超声时间的变化趋势总体一致。因此,选取60 min为最适超声时间。

图3 超声时间对水提液抗氧化活性的影响Fig.3 Effects of ultrasonic time on antioxidant activity of GLMw

2.1.4 超声温度的影响

Muthukumaran等[19]的研究表明,温度的提高能够降低溶剂的表面张力和黏度,从而增加由于超声波空化作用产生的气泡数量,有利于传质。但温度过高会导致蒸汽压力升高,而蒸汽压增加反过来又会因为缓冲导致气泡塌陷,从而抑制空化作用[20]。因此,在液固比50 mL/g、超声功率153 W、超声时间60 min的条件下,考察超声温度对水提液抗氧化活性的影响,结果见图4。由图4可知:温度为40 ℃时自由基清除率显著高于30 ℃的结果。40 ℃后,3种自由基的清除率均随着温度的升高而下降。因此,选取40 ℃为最适超声温度。

图4 超声温度对水提液抗氧化活性的影响Fig.4 Effects of ultrasonic temperature on antioxidant activity of GLMw

2.2 星点设计-效应面优化实验

根据单因素实验结果,选取液固比(X1)、超声温度(X2)、超声功率(X3)和超声时间(X4)为效应因子,设计4因素5水平中心组合优化表(表1)。根据表2列出的条件制备2 mg/mL样品溶液,测定各水提液的抗氧化活性,每份溶液测定3次,取平均值,分别得到S1、S2和S3。

表1 CCD实验设计因素水平

利用熵权法对评价指标S1、S2、S3各自所占权重进行计算。以CCD实验优化设计得到的30组数据为样本,对sij按式(4)进行离差标准化得到对应的yij后,按式(5)分别计算S1、S2和S3的信息熵Ej,按式(6)计算相应权重(wj)。

(4)

(5)

(6)

计算得到S1、S2、S3的权重w1、w2、w3分别为0.388 8、0.354 4、0.256 8。定义加权后的综合抗氧化活性为Z,其计算方法见式(7)。

Z=0.388 8S1+0.354 4S2+0.256 8S3

(7)

以X1、X2、X3和X4为效应因子,Z为效应值,利用Design-Expert进行效应面分析,去掉不显著项(P>0.05)得到的简化后的编码回归方程,见式(8)。

Z=63.38+0.40X1+0.43X2+0.44X3-0.20X4+

(8)

表2 CCD实验优化设计及结果

表3 CCD回归模型可信度分析

表4 CCD回归模型方差分析

在各实验因素的取值范围内,根据拟合后的回归方程计算得到综合抗氧化活性Z最大时对应的实验条件,将其进行规整以便于实际操作,具体实验条件如下:液固比50 mL/g、超声时间60 min、超声温度40 ℃、超声功率156 W,该条件下的灵芝菌丝体水提液综合抗氧化活性的预测值为63.48%,实验值为62.06%,二者接近(相对标准偏差RSD<3%)。

3 结论

1)通过灵芝菌丝水提液的DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率和羟自由基清除率评价其体外抗氧化活性。通过对不同提取条件的研究,发现提取过程中的液固比、超声时间、超声温度及超声功率对水提液的抗氧化活性均有影响,且随着提取条件的改变,3种自由基清除率虽然有差异,但变化规律基本一致。

2)通过CCD实验优化,对30组不同条件下得到的灵芝菌丝体水提液的自由基清除率进行熵权法赋权,权重分别为0.388 8(DPPH自由基清除率)、0.354 4(羟自由基清除率)和0.256 8(ABTS自由基清除率),以加权后得到的综合抗氧化活性为效应值进行优化,使得灵芝菌丝体水溶性抗氧化活性成分的提取更为全面。

3)灵芝菌丝体水溶性抗氧化活性成分的最佳超声提取工艺参数为液固比50 mL/g、超声时间60 min、超声温度40 ℃、超声功率156 W,该条件下进行实验验证,得到综合抗氧化活性为62.06%,与预测值63.48%相近(RSD<3%)。