甘蓝型油菜BnNF-YA1的克隆和功能鉴定

林科运 段钰晶 王高升 孙念礼 方玉洁 王幼平

（扬州大学生物科学与技术学院，扬州 2250009）

甘蓝型油菜（Brassica napus L.）属于十字花科（Cruciferae）芸薹属（Brassica）［1］，其不同部位具有不同的经济价值：油菜籽的出油率高，可作为食用油；油菜本身也含有大量蛋白质，是动物饲料重要来源；除此之外，发达国家也会利用油菜制成生物柴油来取代部分化石燃料［2-5］。我国油菜的种植面积和总产量均居世界前列，然而我国人口众多，对菜籽油的需求量日趋增大，导致我国菜籽油每年的进口量不断上升［6］。近年来，全球生态环境持续恶化，自然灾害频发，包括干旱、高盐、极端温度等在内的环境胁迫对油菜的生长发育和产量造成了严重威胁［7］，使得我国食用油供求不平衡的状况日益严峻。因此，挖掘油菜逆境应答相关遗传资源、提高油菜抗逆性对于油菜生产具有重要意义。

为更好地适应不利的环境条件并得以生存，植物在进化历程中形成了一套完整且复杂的逆境应答机制，植物在响应非生物胁迫的过程中涉及多个层面的基因表达调控，包括激素调节、转录水平调节以及转录后水平调节逆境相关基因等［8-10］。前人研究表明，MYB、AP2/ERF、bZIP、Zinc finger、NAC、WRKY、NF-Y等转录因子家族在植物逆境应答调控中发挥着重要作用［11］。植物核因子Y（nuclear factor Y，NF-Y）类转录因子是一类结构保守的三聚体复合物，由NF-YA、NF-YB和NF-YC三亚基组成，对CCAAT-box元件具有高度特异性和高度亲和力［12-13］。NF-YA的核心保守区域包含大约56个氨基酸［14］，可分成2个结构域以及中间的连接区，其中一个A1结构域是由20个氨基酸形成的α螺旋，位于蛋白N端，是与NF-YB/NF-YC互作所必需的；另一个A2结构域位于蛋白C端，是由21个氨基酸组成的α螺旋，可以特异性结合启动子序列上的CCAAT-box［15］。NF-YB 亚基存在与 H2A 结构域极相似的组蛋白折叠模体（histone fold motif，HFM），该区域由3个α螺旋和2个β链组成，以α1-β1-α2-β2-α3排列顺序组成，α1主要负责与 CCAAT附近的DNA骨架结合，α2、α3区域与NF-YC结合形成二聚体，NF-YC的结构特征与NF-YB相似［16］。NF-Y复合体在行使功能时，NF-YB亚基和NF-YC亚基通过组蛋白折叠结构域（histone folding domain，HFD），采用从头到尾的组装方式［17］，在细胞质中先形成异源二聚体，随后迁移到细胞核中与NF-YA亚基结合形成完整的异源三聚体，A2结构域将利用A1和A2之间的连接螺旋在DNA上滑动，寻找CCAAT-box序列，随后NF-YA插入到DNA双螺旋的小沟中，DNA发生弯曲，使得其他转录因子更容易结合到DNA双螺旋的大沟，进而调控下游的靶基因［18-20］。NF-YA、NF-YB和NF-YC亚基自身也可以单独行使特定的功能［21］。

近年来，NF-YA在各种植物中的功能逐渐被挖掘，研究发现，NF-YA转录因子广泛参与了植物对各种生物与非生物胁迫应答以及植物的生长发育过程。拟南芥NF-YA5受干旱胁迫强烈诱导，过表达AtNF-YA5使转基因拟南芥叶片的气孔孔径变小、失水速率降低，同时激活胁迫响应基因的表达，增加了拟南芥的抗旱性［22］。水稻OsNF-YA7受干旱胁迫诱导表达，而不受脱落酸（abscisic acid，ABA）诱导表达，过表达OsNF-YA7能够提高转基因植株的耐旱性，说明OsNF-YA7通过不依赖ABA的方式介导水稻的耐旱性调控［23］。棉花GhNF-YA10和GhNF-YA23受盐胁迫、干旱胁迫和ABA处理诱导表达，在棉花中利用VIGS技术对GhNF-YA10和GhNF-YA23进行沉默导致棉花幼苗在盐胁迫条件下萎黄、耐盐性显著性降低［24］。大豆GmNF-YA3受ABA、PEG、NaCl和冷胁迫诱导表达，过表达GmNF-YA3的转基因拟南芥耐旱性增强，而对盐胁迫和ABA处理的敏感性增强［25］。GmNF-YA5在大豆的21个NF-YA基因中转录水平最高，过表达GmNF-YA5的转基因大豆耐旱性增强，且转基因植株中ABA依赖型和ABA非依赖型基因表达水平升高，暗示着其能通过依赖和不依赖ABA的途径介导大豆耐旱性调控［26］。研究者从耐盐小麦品种SR3中鉴定到TaNF-YA10-1，组成型表达TaNF-YA10-1的拟南芥植株对盐胁迫的敏感性提高，而耐旱性增强，说明其在应答干旱和盐胁迫中的功能是相对独立的［27］。Lian等［28］将毛果杨 PtNF-YA9在拟南芥中过表达获得OxPtNA9材料，OxPtNA9株系在萌发阶段对模拟干旱、ABA和盐胁迫表现出敏感性，萌发后生长停滞，而在苗期则通过促进气孔关闭、提高水分利用效率、减少失水表现出对干旱的耐受性增强；与对照相比，OxPtNA9系在含有NaCl的1/2 MS培养基中表现出较长的初生根，在土培条件下也表现出更强的耐盐性，说明PtNF-YA9采取一种驯化策略来应对不利的环境条件。甜橙CsNF-YA5在叶片和根系中对缺水的应答表现出差异，在烟草中过表达CsNF-YA5能够使转基因植株在脱水条件下减少H2O2的产生，并在正常和干旱胁迫条件下提高植株的生长和光合速率，这些生理生化反应有助于甜橙应对短期土壤缺水的环境［29］。除了调控植物对胁迫环境的应答，NF-YA还被报道参与调控植物的根系发育［30］、开花［31］、胚胎和种子发育等多种生物学过程［32-33］。

NF-YA生物学功能的多样性引起了学者们广泛的关注，目前，研究者们已陆续在大豆、拟南芥、小麦、马铃薯、玉米等植物中鉴定出许多NF-YA家族成员［34-37］。前人对甘蓝型油菜中NF-Y家族成员进行了初步鉴定和表达分析［38-39］，但油菜中关于NF-YA的功能研究尚不深入。

本研究通过克隆BnNF-YA1的编码序列，对其序列特征和表达特性进行分析，获得过表达BnNFYA1的甘蓝型油菜植株，并对其进行逆境胁迫表型鉴定，为深入研究BnNF-YA1在甘蓝型油菜逆境应答中的调控作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

甘蓝型油菜转化受体材料为甲9712（J9712），由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室周永明教授惠赠。利用已测序甘蓝型油菜Darmor-bzh的cDNA样品作为基因片段扩增的模板。Darmorbzh及用于瞬时表达分析的本氏烟草（Nicotiana benthamiana L.）种子由扬州大学生物科学与技术学院油菜生物学实验室保存。

大肠杆菌感受态Trans-T1购自北京全式金生物技术有限公司。Phanta Max Super-Fideity DNA Polymerase、RNA isolater Total RNA Extraction Reagent、琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、重组克隆试剂盒购自南京诺维赞生物科技有限公司。逆转录试剂盒、限制性内切酶购自New England Biolabs公司。引物合成及DNA测序委托南京擎科生物技术有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 BnNF-YA1的生物信息学分析 通过Protpraram（https://web.expasy.org/protparam/）对 BnNF-YA1蛋白进行理化性质分析；利用Expasy（https://web.expasy.org/protscale/）进行亲/疏水性分析；利用Expasy的TMHMM在 线 软 件（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）进行跨膜结构域分析；利用软件 Netphos（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）进行蛋白磷酸化位点分析。分别利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）和在线网站SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive#sequence）进行二级结构和三级结构预测；通过在线网站CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）进行保守结构域分析；利用SignalP-5.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）进行信号肽预测。利用在线网站SWISS-MODEL进行三级结构预测。利用DNAMAN对BnNF-YA1及其同源蛋白序列进行多序列比对分析；利用MEGAX64对BnNF-YA1及其同源蛋白进行系统发生分析［40］。

1.2.2 BnNF-YA1的克隆 利用油菜公共数据库Brassica napus Genome Browser（http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/cgi-bin/gbrowse/colza/）获取候选基因的序列信息。使用软件Primer Premier 5.0设计特异性引物（BnNF-YA1-F：5′-GCTTCACGGCTCTTCTAA-3′，BnNF-YA1-R ：5′-CTATTCCCCCATCTCTCG-3′），委托南京擎科生物科技有限公司合成引物，扩增BnNF-YA1编码序列。

1.2.3 BnNF-YA1的表达分析 为了了解BnNF-YA1逆境表达模式，对4叶期的甘蓝型油菜幼苗进行不同逆境条件处理。干旱处理：15% PEG模拟干旱，分别在处理前、叶片轻度、中度、重度萎蔫时取样；冷处理：4℃处理，分别在处理0、3、6 和12 h取样；热处理：42℃处理，分别在处理0、0.25、0.5和1 h取样；ABA处理：喷施0.6 μmol/L ABA，分别在处理0、0.5、1和3 h取样，检测BnNF-YA1的表达量。为了获得BnNF-YA1的时空表达模式，检测BnNF-YA1在子叶（cotyledon）、幼叶（seedling leaf）、根（root）、茎（stem）、花苞（bud）、花（flower）、受精后20 d角果（20 DAP silique）、受精后30 d种子（30 DAP seed）等组织器官中的表达情况。

1.2.4 BnNF-YA1过表达载体的构建和遗传转化 利用RNA isolater Total RNA Extraction Reagent试剂盒抽提甘蓝型油菜Darmor-bzh的总RNA，并使用HiScript® Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）试剂盒对总RNA样品进行反转录获得cDNA。利用基因特异性引物（BnNF-YA1-F：5′-GCTTCACGGCTCTTCTAA-3′，BnNF-YA1-R ：5′-CTATTCCCCCATCTCTCG-3′），以 cDNA 为模板，用 Phanta Max Super-Fideity DNA Polymerase对BnNF-YA1的CDS片段进行PCR扩增，利用酶切连接法（Pac I、Asc I双酶切）将测序验证无误的目标片段构建到pMDC83骨架载体上，构建获得BnNF-YA1过表达载体，命名为BnNF-YA1-OE。

使用电击转化法将BnNF-YA1-OE载体转化至农杆菌GV3101感受态细胞中，利用含有卡那霉素（kanamycin，Kan）和利福平（rifampicin，Rif）的LA培养基筛选阳性克隆，并利用菌落PCR进行阳性鉴定（鉴定引物为 35S-F ：5′-CAAGACCCTTCCTCTAT-3′；BnNF-YA1-R：5′-CTATTCCCCCATCTCTCG-3′），将阳性农杆菌菌株保存于-80℃备用。利用农杆菌侵染法将BnNF-YA1-OE载体转化到甘蓝型油菜中，转化过程在华中农业大学遗传改良国家重点实验室报道的方法基础上对激素浓度略有调整［41］。

1.2.5 转基因植株的分子鉴定 取转基因植株的叶片抽提DNA［42］，并进行PCR阳性鉴定（使用引物为：35S-F ：5′-CAAGACCCTTCCTCTAT-3′；BnNF-YA1-R ：5′-CTATTCCCCCATCTCTCG-3′）。 利 用 RNA isolater Total RNA Extraction Reagent试剂盒，对转基因阳性植株和阴性对照植株抽提叶片总RNA，并使用HiScript® Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）试剂盒进行反转录。利用qPCR检测BnNF-YA1在转基因植株中的表达量（定量引物为BnNF-YA1-QF：5′-CTTCAGGTGCACCATAAT-3′；BnNF-YA1-QR ：5′-CTAACACCTAACATCACT-3′），以 BnActin 作为内参基因（定量引物为Actin-F：5′-TCTTCCTCACGCTATCCTCCG-3′；Actin-R ：5′-AGCCGTCTCCAGCTCTTGC-3′），采用 2-△△CT法计算目的基因相对表达水平［43］。

1.2.6 甘蓝型油菜逆境胁迫表型鉴定 选取BnNFYA1表达量较高的3个转基因阳性过表达T2代株系（分别命名为BnNF-YA1-OE-1、BnNF-YA1-OE-2和BnNF-YA1-OE-4），以J9712为对照，进行子叶期逆境胁迫表型鉴定。选取状态一致的J9712和BnNFYA1-OE种子接种到1/2 MS培养基上，培养24 h后将萌发状态相对一致的种子转移到无菌1/2 MS培养基和分别含有15% PEG和20 μmol/L甲基紫精（methyl viologen，MV）的1/2 MS培养基上，每个培养罐平均分为4个区域，分别均匀接种J9712、BnNFYA1-OE-1、BnNF-YA1-OE-2和BnNF-YA1-OE-4，每个培养罐中每个材料接种15颗种子，置于16 h光照/8 h黑暗条件下培养7 d，记录幼苗的生长情况。

1.2.7 BnNF-YA1的转录激活活性分析 构建pGBKT7-BnNF-YA1载体，利用酵母快速转化方法将pGBKT7-BnNF-YA1质粒转化到Y2HGold酵母菌株感受态细胞中，挑取阳性酵母转化子接种于液体培养基中培养并按梯度稀释后打点于SD/-Trp、SD/-His/-Trp、SD/-Ade/-Trp和SD/-His/-Ade/-Trp固体培养基上，30℃倒置培养3-5 d，观察酵母菌生长情况。

1.2.8 BnNF-YA1的亚细胞定位分析 构建C端融合GFP的BnNF-YA1表达载体，命名为35S∶BnNFYA1-GFP，将该载体转化农杆菌GV3101感受态细胞并挑取阳性克隆进行保种。利用农杆菌侵染介导的烟草表皮瞬时表达体系对BnNF-YA1蛋白进行亚细胞定位分析，对照注射包含空载体35S∶GFP的GV3101农杆菌菌液。利用Zeiss LSM 880NLO双光子激光扫描共聚焦显微镜观察GFP荧光在烟草表皮细胞中的分布情况。

2 结果

2.1 BnNF-YA1生物信息学分析

2.1.1 理化性质分析 通过Protpraram对BnNF-YA1进行理化性质分析，结果表明，BnNF-YA1开放读码框为858 bp；分子式为C1320H2046N412O435S13；编码285个氨基酸，其中缬氨酸的含量最多，带负电荷的残基（Asp、Glu）一共有36个，带正电荷的残基（Arg、Lys和His）有43个；BnNF-YA1蛋白质的相对分子质量为31.064 kD；理论等电点为6.11。

2.1.2 亲/疏水性分析和跨膜结构分析 利用Expasy对BnNF-YA1蛋白亲/疏水性进行分析，如图1-A所示，BnNF-YA1蛋白在第21个氨基酸的分值为-2.878，在第134个氨基酸的分值为1.500，分别表示最低值和最高值，从整体上分析，BnNF-YA1蛋白的氨基酸分值大部分为负值，即亲水性氨基酸在肽链中的含量较高，亲水性氨基酸的平均分值也大于疏水性氨基酸的平均分值，因此，推测BnNFYA1为亲水性蛋白质。对BnNF-YA1进行跨膜结构分析，结果表明，BnNF-YA1整条肽链不存在跨膜区域，存在跨膜结构的可能性低于0.001，可推测BnNF-YA1不属于跨膜蛋白。

图1 BnNF-YA1亲/疏水性、磷酸化位点、二级结构、三级结构分析Fig.1 Analysis of hydrophilicity/hydrophobicity，phosphorylation site，secondary structure and tertiary structure of BnNF-YA1

2.1.3 磷酸化位点结构预测 对BnNF-YA1蛋白磷酸化位点进行在线预测，结果（图1-B）显示，3S、5S、48S、55S、56S、65S、70S、90S、94T、98S、115S、143Y、148Y、173T、180T、185Y、232S、240T、261S、263T、265S、266S、268S、273T、278T被预测为潜在的磷酸化位点，分数均高于阈值（0.500），其中232S的得分为0.995，表明BnNFYA1很可能存在多个磷酸化位点。

2.1.4 二级结构与三级结构预测 对BnNF-YA1二级结构进行分析，结果（图1-C）显示，BnNF-YA1主要由28.77%的α螺旋（包含82个氨基酸）、4.56%的延伸链（包含13个氨基酸）、3.16%的β转角（包含9个氨基酸）以及63.51%的无规卷曲（包含181个氨基酸）等4个部分共同组成。对BnNF-YA1进行三级结构预测的结果如图1-D所示，预测结果显示，BnNF-YA1蛋白第180-285位氨基酸区段存在一个功能域，负责识别或者结合真核基因启动子区域的CCAAT顺式作用元件，在特定的时间与空间激活或者抑制目的基因的表达。

2.1.5 功能域与信号肽预测 对BnNF-YA1保守结构域进行分析，发现BnNF-YA1在第180-235位氨基酸区域存在保守的CBFB_NFYA结构域，属于CCAAT结合蛋白家族。进一步的信号肽预测表明，该蛋白不存在信号肽。

2.1.6 NF-YA1序列比对和系统发生分析 利用BnNF-YA1全长蛋白对应的氨基酸序列在NCBI中进行Blast检索，获取多个植物物种中NF-YA1的同源蛋白序列，选取包括甘蓝、白菜、水稻、玉米、拟南芥、大豆等物种在内的6条序列进行多序列比对（部分比对结果如图2），并构建系统发生树（图3），BnNF-YA1与同为十字花科的甘蓝中的BoNF-YA1亲缘关系较近，而与其他植物中同源蛋白的亲缘关系较远。

图2 BnNF-YA1同源序列比对Fig.2 Multiple sequence alignments of BnNF-YA1 and its homologs

图3 NF-YA1系统发生分析Fig.3 Phylogenetic analysis of NF-YA1 proteins

2.2 基因表达分析

为探究BnNF-YA1的生物学功能，对BnNF-YA1在各种逆境胁迫处理条件下以及甘蓝型油菜不同生长发育时期各组织器官中的表达模式进行分析（图4-A），BnNF-YA1对多种逆境胁迫处理均表现出了不同程度的响应：受NaCl、PEG处理、高温胁迫和ABA处理诱导上调表达，而受冷胁迫诱导下调表达，说明BnNF-YA1很有可能在甘蓝型油菜响应逆境的过程中发挥作用。在PEG模拟干旱胁迫处理条件下，BnNF-YA1的表达随着胁迫程度的加深不断上升，在重度胁迫条件下其表达达到峰值。在高温胁迫和ABA处理条件下，BnNF-YA1的表达则表现出先上升后回落的趋势。对BnNF-YA1时空表达模式分析，结果（图4-B）显示，BnNF-YA1在油菜各组织器官中均有不同程度的表达，其在幼叶、花苞和受精后20 d的角果中表达水平较高，暗示其可能在相应的生长发育阶段发挥功能。

图4 BnNF-YA1表达模式分析Fig.4 Expression profile of BnNF-YA1

2.3 过表达材料获得

以甘蓝型油菜下胚轴为外植体，利用农杆菌介导的遗传转化方法将BnNF-YA1-OE过表达载体（载体骨架如图5-A）导入油菜中，依次经过侵染、共培养、筛选、分化、生根等过程，获得24株再生植株。对再生植株进行PCR阳性鉴定（图5-B），除10、14外，其余的均为阳性转基因苗，阳性率为91.66%。

对转基因植株抽提RNA（图5-C）并进行反转录（图5-D），利用qPCR对阴性对照植株和部分阳性植株中BnNF-YA1的表达水平进行检测（图5-E），与对照相比，BnNF-YA1在转基因阳性植株中的表达量均有不同程度的升高。

图5 BnNF-YA1-OE过表达材料获得Fig.5 Generation of BnNF-YA1-OE transgenic rapeseed plants

2.4 子叶期表型鉴定

为了研究BnNF-YA1在甘蓝型油菜逆境应答中的作用，选取BnNF-YA1表达水平较高的3个株系 BnNF-YA1-OE-1、BnNF-YA1-OE-2和 BnNF-YA1-OE-4进行繁种，并对T2代材料进行了培养基上的胁迫处理试验。如图6-A所示，在正常条件下，对照J9712与BnNF-YA1-OE转基因株系幼苗的根长、下胚轴以及鲜重没有明显差异；但在15% PEG和20 μmol/L MV处理7 d后，与对照相比，BnNF-YA1-OE幼苗的下胚轴显著长于对照，说明15% PEG模拟的干旱胁迫和20 μmol/L MV的氧化胁迫对BnNF-YA1-OE材料生长的抑制程度比对J9712生长的抑制程度轻，说明过表达BnNF-YA1使甘蓝型油菜对渗透胁迫和氧化胁迫的耐受性增强，BnNF-YA1正调控甘蓝型油菜对PEG和氧化胁迫的耐受性。

图6 BnNF-YA1-OE T2代转基因植株子叶期表型鉴定Fig.6 Phenotypic identification of T2 generation of BnNFYA1-OE transgenic plants at the cotyledon stage

2.5 亚细胞定位

为研究BnNF-YA1蛋白的特性，构建了C端融合GFP的BnNF-YA1亚细胞定位载体并转化农杆菌，利用烟草表皮细胞进行瞬时表达，培养36 h后，利用激光共聚焦显微镜进行观察，发现GFP荧光信号位于细胞核（图7），说明BnNF-YA1蛋白定位在细胞核中。

图7 BnNF-YA1蛋白亚细胞定位Fig.7 Subcellular localization of BnNF-YA1 protein

2.6 转录激活活性检测

为了分析BnNF-YA1蛋白的转录激活活性，构建pGBKT7-BnNF-YA1载体并利用酵母系统进行转录激活活性分析（图8），包含pGBKT7-BnNF-YA1质粒的阳性酵母转化子在SD/-Trp培养基上长势正常，而在SD/-Trp/-His、SD/-Trp/-Ade和SD/-Trp/-His/-Ade缺陷型培养基上均不能生长，说明BnNF-YA1全长蛋白没有转录激活活性。

图8 BnNF-YA1全长蛋白自激活活性分析Fig.8 Transactivation activity analysis of BnNF-YA1 fulllength protein

3 讨论

NF-YA类转录因子被报道在植物逆境应答过程中发挥重要作用，然而，该家族转录因子在油菜逆境应答中的功能研究还十分有限，有待深入。本研究中克隆的BnNF-YA1编码的蛋白质在第180-235位氨基酸区域存在保守的CBFB_NFYA结构域，属于NF-YA家族转录因子。从系统发生关系来看，BnNF-YA1与同为十字花科的甘蓝XP_013611224.1亲缘关系较近，而与其他植物的NF-YA1蛋白亲缘关较远，推测BnNF-YA1与XP_013611224.1在进化上具有相同的祖先。

根据前人的研究报道，NF-YA蛋白通常定位于细胞核中［44］。为了明确BnNF-YA1的定位情况，本研究利用烟草表皮细胞瞬时表达系统分析了BnNFYA1蛋白在亚细胞水平的分布，发现BnNF-YA1蛋白定位于细胞核内，这也与生物信息学分析表明该蛋白不具有跨膜结构域的结果相符，说明BnNFYA1在细胞核内发生作用，符合典型的转录因子亚细胞定位特征。为了进一步了解BnNF-YA1蛋白的特性，利用酵母系统对其进行转录激活活性检测，结果显示，BnNF-YA1全长蛋白并不具有转录激活活性。前人研究结果表明NF-YA是组成NF-Y三聚体蛋白的一个亚基，完整的NF-Y因子常常具有转录激活活性［12］。因此，推测NF-Y三聚体发挥转录激活功能很可能需要NF-YA和NF-YB/C的协同作用，BnNF-YA1亚基无法独立发挥转录激活的功能。此外，还存在另外一种可能性，即BnNF-YA1是一个转录抑制子。

通过对BnNF-YA1进行表达分析，发现BnNFYA1对多种非生物胁迫和ABA处理均表现出响应，在PEG、高温胁迫和ABA处理条件下其表达水平上调，而在冷胁迫处理条件下其表达水平下调，暗示该基因在甘蓝型油菜对干旱、高温和低温胁迫响应过程中可能发挥重要的调控作用。进一步转基因功能验证的结果显示，过表达BnNF-YA1的T2代植株在面临15% PEG模拟干旱胁迫和20 μmol/L MV氧化胁迫时，下胚轴显著长于对照植株的下胚轴，说明其过表达植株在胁迫条件下受到的氧化损伤较轻，说明过表达BnNF-YA1在一定程度上增强了甘蓝型油菜对渗透胁迫和氧化胁迫的抗性。已有研究证实，利用NF-YA基因能够有效提高植物对非生物胁迫的抗性。例如：在拟南芥中异源过表达BnNFYA9使得转基因植株对NaCl和甘露醇等非生物胁迫以及ABA处理的抗性增强，在NaCl和ABA处理条件下，过表达BnNF-YA9拟南芥种子的萌发速度、根的伸长率、植株的根系等指标均比野生型的相应指标表现更好［45］。异源过表达SiNF-YA5可提高拟南芥的抗盐性，在高盐处理条件下，与野生型拟南芥相比，过表达SiNF-YA5的转基因材料种子萌发率提高，苗期根表面积、植株鲜重显著增加［46］。菊花DgNF-YA1基因可以调控抗寒相关基因的表达，从而正调控菊花的耐寒性［47］。本研究结果显示，BnNFYA1正调控甘蓝型油菜对渗透胁迫和氧化胁迫的抗性，有望作为提高油菜抗逆性的有利遗传资源。目前，BnNF-YA1参与甘蓝型油菜逆境应答的分子机制尚未明确。BnNF-YA1在甘蓝型油菜中能够与哪些NFYB/NF-YC因子发生相互作用？BnNF-YA1通过调控哪些下游靶基因来参与油菜逆境应答？这些都是在后续研究中值得关注的问题。

4 结论

从甘蓝型油菜中克隆到BnNF-YA1基因，开放读码框序列为858 bp，编码285个氨基酸，存在保守的CBFB_NFYA结构域，属于NF-YA家族。BnNF-YA1受PEG处理、高温胁迫和ABA处理诱导上调表达，且在幼叶、花苞以及受精后20 d的角果中表达水平较高。BnNF-YA1蛋白定位在细胞核中，其全长蛋白没有转录激活活性，过表达BnNF-YA1能够在一定程度上增强甘蓝型油菜对PEG和MV处理的耐受性，BnNF-YA1参与调控甘蓝型油菜对渗透胁迫和氧化胁迫的抗性。