KASP标记技术在主要农作物中的应用及展望

杨青青 唐家琪 张昌泉 高继平 刘巧泉

（植物功能基因组学教育部重点实验室 江苏省作物基因组学和分子育种重点实验室 江苏省粮食作物现代产业技术协同创新中心 扬州大学农学院，扬州 225009）

遗传变异是农业发展的基础，农作物育种的目的是创造和利用这些遗传变异。在漫长的农作物育种历史中，育种方式经历了原始育种、传统育种和分子育种三个时代的跨越，形成了具有典型时代特征的各种技术版本［1-2］。我国当下农作物的育种方式主要包括传统的常规育种、基于分子标记的辅助选择育种和基于基因遗传修饰的转基因育种等。其中常规育种依赖育种家根据个人经验将所用育种材料的有利基因进行随机组合，效率较低。而分子标记辅助选择育种和转基因育种通常针对个别性状进行精确改良，效率较高。但是由于转基因育种涉及产品商业化问题，所以目前在农业生产中主要以分子标记为主［3］。众所周知，生物性状的遗传调控是由众多基因参与的复杂调控网络。因此，农作物品种的改良涉及一系列功能基因的利用，而高通量基因特异性分子标记的开发与利用将能更有效地促进农作物品种的定向改良［4］。

随着高通量测序技术的发展，目前DNA分子标记已经发展到第三代。第一代是基于分子杂交技术的标记技术，包括限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）；第二代是基于PCR技术的分子标记技术，包括序列标志位点（sequence tagged sites，STS）、简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）、扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）等；而单苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）被称为第三代分子标记：它是基于DNA芯片技术的一种分子标记技术。与第一、第二代分子标记相比，它具有分布密度高、遗传稳定性好、二等位基因型等特点，因此，更容易实现高通量和自动化检测［5］。近些年来，由于下一代测序（next generation sequencing，NGS）等技术的发展，促进了基于芯片的标记平台的开发，各种高通量基因分型技术也被开发和利用起来［6］，如英国政府化学家实验室（Laboratory of the Government Chemist，LGC）基于竞争性等位基因特异性PCR（kompetitive allele-specific PCR，KASP）原理开发的KASP高通量SNP检测技术［7］和美国富鲁达公司（Fluidigm）基于微流体芯片技术开发的Fluidigm基因分型平台［8］。其中KASP技术由于其高通量、低成本和可操作性强等优点而在农作物性状遗传和改良研究领域备受关注，现已发展成为全球基准技术［7］。本文主要从KASP技术的发展、原理和在水稻、小麦、玉米等主要农作物的遗传育种中的应用等方面展开综述，同时展望了其在作物遗传育种中的应用前景。

1 KASP技术的特点与实验原理

1.1 KASP技术的发展与特点

在过去30年中，分子标记从低通量限制性片段长度多态性（RFLP）开始，到最近达到的基于NGS技术的SNP标记，已经经历了三代。KASP是一种基于荧光的同质基因分型技术，最初由英国的KBioscience公司所开发［7］。KBioscience公司成立于2002年，在优化基因分型分析的相关技术以及KASP技术的开发方面拥有近10年的经验。他们不仅开发了一套自己的SNP基因分型仪器，而且拥有约500 000个经过验证的KASP分析库存。随后，该公司在2011年被英国的LGC公司收购。不久，LGC公司开发出了一套灵活、快速且高通量的SNPline仪器平台和实验方案，基于该公司的平台，每天可检测的SNP数量从20-500 000个，样本数可从单个到数万个以上，有很强的灵活性。

KASP技术具有灵活、便宜、准确等特点。一方面，它是以常规PCR和荧光检测为基础，能够在普通实验室操作的基础上满足低、中、高通量基因分型的要求。因此，具有一定的灵活性，更容易实现高通量和自动化检测［7］。另一方面，KASP作为TaqMan的替代品，在原理上与TaqMan类似（也是基于终端荧光读取判断），但它与TaqMan技术的不同之处在于：其采用的是通用探针，可以与各种不同的基因特异引物配合使用，而不需要针对每个特定的位点进行探针合成，这极大降低了实验的试剂成本［9］。研究表明，采用KASP技术的商业服务成本比采用TaqMan探针法低约80%［10］。其次，基于KASP技术的基因分型是一种简单的不依赖于凝胶电泳检测的方法，其不需要专门的设备，研究人员可以使用常规的qPCR仪器进行SNP基因分型，具有良好的兼容性。通过设计两个引物对等位基因特异性单核苷酸多态性位点进行不同方向的扩增，可以将单核苷酸多态性转化为长度多态性。此外，KASP实现了更高的分析设计成功率（98%-100%）和转化为成功的工作检测（93%-94%）（与TaqMan的72%和61%相比）（LGC Genomics应用说明：http://www.kbioscience.co.uk/reagents/KASP_TaqMancomparison.pdf）。而将KASP与基于芯片的Illumina GoldenGate平台相比，KASP对阳性对照DNA样品中的平均基因分型误差为0.7%-1.6%，低于使用GoldenGate观察到的（2.0%-2.4%），具有较高的准确性［7］。

从发展趋势上看，高通量、低成本和操作友好型是分子标记技术发展的主要方向，而KASP检测技术能够同时满足这3个要求。目前该技术已广泛应用于植物、动物和人类的遗传学研究与群体分型［11-13］。研究人员可以选择几种简单的方法进行KASP分析，例如：可以直接向LGC公司或其他商业测试公司提供核酸样本和引物进行检测；或者通过订购KASP试剂，自行利用qRT-PCR仪进行结果分析；又或者购买全套检测设备，建立自己的高通量SNP分析平台。

1.2 KASP技术的实验原理与步骤

KASP是一种基于荧光检测的基因分型技术，能够在复杂的基因组DNA样品中对特定位点上的SNPs和插入缺失（insertion-deletions，InDels）序列进行精准的双等位基因检测。具体的检测体系包括：DNA模板、2个通用荧光探针、2个通用淬灭探针、2个与目标位点特异结合的引物以及共同的反向引物。该技术是基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP以及InDel位点进行检测，即基于PCR反应结束后的荧光读取工作［10］。针对每个孔采用双色荧光检测，一个样本对应一个检测位点，而每个位点都存在3种可能的基因型（纯合1，纯合2或杂合），极大地提高了检测效率。

KASP技术的操作步骤可概括为三大步：第一步，引物和探针设计。首先设计针对特定SNP的2个正向PCR引物，每个引物通过调整3′末端来对应一个SNP的等位基因［14］。例如图1，等位基因1引物3′末端对应A，等位基因2引物3′末端对应C。其次，在每个正向引物的5′末端添加标签序列，如图1中的标签序列1和2。此外，设计与标签序列对应的荧光探针，如探针1和探针2。在探针1的5′端添加有FAM荧光基团，探针2的5′端添加有HEX荧光基团［15］。同时，对应2个探针，各设计一个3′端带淬灭基团的淬灭探针。在实际操作中只需要针对特定SNP设计添加5′末端标签序列的普通引物即可，而探针通常由试剂盒提供。第二步，普通PCR扩增。在第一轮PCR扩增中，等位基因特异引物（3′末端能配对的）就可识别特定等位基因模板，完成等位基因识别（图1）。从第2轮PCR扩增开始，产物中出现携带通用标签序列的模板，这步完成把通用标签序列引入与SNP对应的PCR产物中。随后在PCR扩增过程中，携带荧光的探针通过与通用序列互补的DNA链结合而添加到PCR产物中，经多轮PCR扩增，更多的荧光探针退火到新合成的、没有淬灭基团的互补链上，而逐渐增强PCR产物荧光强度。第三步，荧光检测和分析。利用专用的荧光信号检测仪或普通的荧光定量PCR仪（配有FAM和HEX检测通道）进行信号读取并用软件采集信号和判别等位基因类型。

图1 KASP技术基因分型的基本原理示意图Fig.1 Principal of the KASP genotyping assay

2 KASP技术在主要农作物中的应用

2.1 KASP技术在种质资源鉴定与亲缘关系研究中的应用

种质资源是农业生产最基本的生产资料，是加速农作物育种改良的重要物质基础［16］。同时，种质资源在持续提高作物产量、品质和保证粮食安全等方面发挥着重要作用。种质资源的广泛收集及妥善保存是确保种质资源遗传多样性最有效的方法之一［17］。由于KASP标记的高通量和低成本特性，近些年越来越多的研究利用该标记开展了种质资源的鉴定和应用分析。

在水稻中，Shikari等［18］采用KASP技术对克什米尔河谷的温带水稻种质资源的213个基因组位点进行了分析。通过消除冗余，最终选择了114个SNPs设计成KASP标记。通过群体结构分析，将该批材料分成了3个明显的亚群。Yang等［19］借助已有的SNPs和InDels数据库，成功开发了565对与水稻重要农艺性状相关的KASP标记，并将其中多态性较好的467对标记用于481份水稻种质的群体结构分析。根据KASP标记基因分型结果，将该材料分为3个组群。此外，贵州禾是贵州省特有的一种原生态水稻品种，吴娴等［20］利用120对KASP标记对贵州禾资源和一些其他地区的水稻品种的遗传多样性和群体结构进行了研究。结果表明，贵州禾的遗传多样性较为丰富，与贵州及江苏地方粳稻的亲缘关系更为密切。

在小麦中，谢静敏等［21］设计了5 412对KASP标记对青海省一批小麦品种进行了遗传多态性分析。结果显示KASP标记多态性比率为90.4%，多态性结果显示该批小麦品种可分为5个或12个类群。Federico等［22］用85对KASP标记对168份来自阿根廷和其他国家的硬粒小麦的遗传多样性进行分析，得出遗传分化系数值为0.139。这些品种可被分为两个亚群，并且发现其分析结果与119份材料中使用AFLP标记分析所获得的信息是互补的。Zhang等［23］将与小麦籽粒产量、品质、适应性和抗逆性有关的44个SNPs开发成KASP标记，进而对207份面包小麦品种进行群体结构分析，将其分为两个亚组：第一亚群主要指宁夏的地方品种和栽培品种；第二类主要是从国外和中国其他省份引进的品种。

在玉米中，陆海燕等［24］利用不同来源的玉米自交系全基因组重测序数据鉴定出了一系列SNPs位点并开发出700对KASP分子标记，从中选择202对具有代表性KASP标记进一步用于系统进化树构建及群体结构分析。结果显示，基于KASP标记位点的聚类分析结果和基于总SNPs位点的聚类分析结果高度吻合，两者的遗传距离相似性系数高达89.5%，能成功区分玉米的杂种优势群。因此，KASP标记亦可在玉米种质资源分析、以及杂种优势群划分等方面发挥重要作用。

在其它农作物方面，Yang等［25］选择了53对KASP标记对34份大白菜材料进行基因分型，这53对标记平均分布在每条染色体上。通过对该批材料的遗传多样性的评估，可将这34份材料根据抽穗类型分为三大类。Shen等［26］通过对西兰花基因型进行全基因组测序，选择了100个SNPs用于KASP标记的开发。随后利用这些标记对372份西兰花材料进行群体结构分析，发现这些材料可分为两个主要类群，但类群分化相对较弱。王富强等［27］使用一批葡萄种质筛选出46对优质KASP标记。而其中的25对标记即可对这些材料进行有效区分，鉴定效率达到95.69%。聚类分析结果显示可将该批葡萄种质细分为6个亚类。Wang等［28］利用成功开发的78对（转化率为61.41%）KASP标记将94份小扁豆材料分为两个主要类群：国内种质和国外种质，并且发现国内种质的聚类更为集中，而国外种质的分布则更为广泛。这与使用EST-SSR标记的分类结果高度一致。此外，KASP技术还被用于咖啡［29］、花生［30］等农作物的种质资源鉴定和亲缘关系等方面的研究。

2.2 KASP技术在分子标记辅助育种中的应用

传统育种一般是通过对群体中大量个体进行性状观测来选育优良后代，这一过程不仅操作繁琐、耗费时间，而且效率低下。随着分子生物技术的快速发展，分子标记辅助选择已经成为现代分子育种的有效工具［31-32］。在众多的分子标记中如何选择高通量且低成本的分子标记是现代分子标记辅助育种研究中所首要关注的。基于KASP标记在成本和通量方面的优势，其在农作物的标记辅助选择育种中也得到了广泛应用。

在水稻中，Shao等［33］基于水稻基因组计划（rice genome project，RGP）的3 000份重测序数据，对控制稻米直链淀粉含量的Wx基因开展了等位变异分析，并成功开发了6对KASP标记，这些标记大致能够区分现有的所有Wx等位基因材料。他们利用这些标记对1976-2018年的杂交亲本品种进行了Wx基因分型发现，杂交稻亲本中主要存在3种Wx等位类型：Wxa、Wxb和Wxlv。Wxb广泛应用于杂交水稻的父本；Wxa和Wxlv用于早期杂交稻的母本，并随着杂交稻的选育进程，逐渐被Wxb所取代。另外，根据Wxmq基因第4外显子的SNPs信息，牛付安等［34］开发了Wxmq-KASP，用其对一些粳稻软米品种和相关F2群体进行了基因分型研究，证明Wxmq-KASP可以高效应用于水稻低直链淀粉含量的分子标记辅助选择育种。Addison等［35］对2 932份水稻品种的香味基因Badh2的SNPs进行了分析，开发出能区分Badh2单倍型的9对KASP标记，并对一些美国水稻材料进行检测，发现Hap6能够有效鉴定美国种质中的香味品种。同年，Li等［36］开发了两对与Badh2-E2（第2外显子的7 bp缺失）和Badh2-E7（第7外显子8 bp缺失及3 bp变异）等位基因变异相关的KASP-SNP标记，并将其应用于香稻种质鉴定和F2群体筛选。结果发现，164份香米品种中有160份可以使用这两对标记进行鉴定，并推测大多数香米品种携带Badh2-E2和Badh2-E7两种等位类型。李瑶等［37］开发了SKC1NB（耐盐性）-KASP，利用该标记对一个BC3F2群体进行了检测，发现其能够有效区分群体中纯合个体和杂合个体。此外，在抗病性方面，一些研究证明KASP标记能够很好地鉴定水稻材料中抗病基因的不同等位基因类型［38-41］。

在小麦方面，KASP技术多用于与小麦抗病性和抗非生物胁迫相关的基因方面的研究。例如，Rasheed等［42］开发并鉴定了152对与普通小麦适应性、产量、品质、生物和非生物胁迫抗性相关的KASP标记，并利用这些标记对4个小麦分离群体的基因型进行鉴定，结果显示所有的KASP标记都与栽培品种以及双亲群体中的相关表型显著关联。该研究还发现KASP标记的检测效率是基于凝胶电泳的传统PCR标记的45倍，并且能有效提高杂交亲本和高代品系的鉴定效率。2018年，Qureshi等［43］借助20对KASP标记证实了小麦抗条锈病Yr34和Yr48为同一个基因。而在这之后，Fang［44］就小麦抗叶锈基因Lr34开发了两对KASP标记：Lr34-E11-KASP和Lr34-E22-KASP，这两对标记可在小麦育种工程中加速对Lr34基因的选择。Rehman等［45］选择与小麦耐旱性相关的16个基因座的等位基因开发了KASP标记，对47份小麦材料进行了等位变异与籽粒产量的相关性分析。该批KASP标记的转化率＞98%，并且其对材料的分析结果与基于凝胶的PCR标记的分析结果一致。此外，王志伟等［46］利用3对抗旱基因的KASP标记（TaDreb_SNP、fehw3_SNP、CWI4A_SNP）和3对抗穗发芽基因的KASP标记（PHS_646、SDR_SNP、Vp1b1-83_IND）对云南育成的小麦品种（系）进行了基因型检测，发现这6对标记能够有效区分抗穗发芽和易穗发芽的品种以及抗旱和非抗旱品种。Su［47］就小麦赤霉病（fusarium head blight，FHB）开发了TaHRC-KASP标记，并对来自中国和日本的几个抗赤霉病的地方品种进行了筛选，发现在不同背景下，TaHRC-KASP标记均可鉴定Fhb1基因。另外，Khalid等［48］利用124对KASP标记，对一批六倍体小麦品系进行分析，以研究87个具有育种价值的功能基因的等位变异规律。从而为进一步调控小麦重要农艺性状的表达提供了一套目标基因。Anuarbek等［49］利用32对KASP标记分析了来自哈萨克斯坦的四倍体硬粒小麦材料，并对主要农艺性状进行评估，发现其中有8对KASP标记的检测结果与小麦的5个农艺性状显著相关。

在玉米方面，Jagtap等［50］开发了100对与高温胁迫响应（heat stress response，HSR）有关基因的KASP标记，发现其中71%的标记具有多态性，21%的标记只产生一种基因或只有杂合型基因，其余的8%未能产生有用的扩增信号。通过比较，发现该研究中的KASP标记开发有效率（71%）高于小麦［51］（67%）和水稻［52］（49.9%），但低于鹰嘴豆［11］（80.6%）。此外，BoлкoBa等［53］以玉米为例，介绍了KASP基因分型的结果及其在遗传育种和种子生产中的应用，证明通过KASP基因技术进行的基因组选择能够有效提升玉米抗旱性遗传改良。

在其它作物中，Ongom等［54］利用开发的17个豇豆KASP标记对225个杂交组合产生的1 436个F1代植株进行了分子指纹图谱和杂合性检测，结果表明KASP标记能够对缸豆亲本和杂合体有效区分，为缸豆的分子育种提供了重要信息。王鹏等［55］设计了抗番茄黄花曲叶病毒病基因Ty-1和抗根结线虫基因Mi-1的KASP标记，并结合已报道的抗番茄花叶病毒病基因Tm-22、抗番茄斑萎病毒病基因Sw-5和抗镰刀菌颈腐根腐病基因Frl的KASP标记，进行了番茄抗病基因KASP分型检测，所得检测结果与传统分子标记检测结果一致。张敬敬等［56］开发了西瓜抗枯萎病、抗炭疽病、抗白粉病性状相关的3对KASP，对130份西瓜材料进行了分析，根据检测结果将试验材料分为携带不同抗病基因的4类。棕色中脉（bmr）表型是高粱的一种隐性性状，会导致木质素的总体减少［57］。Burow等［58］开发了15对KASP标记（6对用于bmr6，9对用于bmr12），用于在高粱苗期对bmr6和bmr12的等位变异进行研究。因为bmr6和bmr12表现出隐性上位型基因互作，因此，这些KASP标记有助于从单个突变体中鉴定出双突变类型。孟君仁等［59］利用5对KASP标记对桃的自然群体和分离群体进行了检测，表明开发的KASP标记可高效检测桃果实外观、抗性、肉质等重要性状相关基因的等位变异。此外，KASP技术在马铃薯［60］、苹果［61］、辣椒［62］和向日葵［63］等作物中也进行了相关的育种研究。

2.3 KASP技术在遗传图谱构建与基因定位中的应用

遗传图谱的构建是基因定位和克隆的前提，其在数量性状位点（quantitative trait locus，QTL）的遗传鉴定中发挥关键作用［64-65］。早期的遗传图谱构建所采用的分子标记主要是第一代和第二代分子标记，由于这些分子标记在基因组中分布密度较低，基于这些标记所定位到的QTL往往因为精度有限而无法开展后续的QTL精细定位和克隆。近些年来，随着技术的进步和测序成本的降低，大规模重测序已经成为可能。利用广泛的重测序可以挖掘大量的遗传标记，这为构建高密度遗传图谱提供了强有力的数据支持［66］。其中SNP阵列是一种强大而有效的QTL作图方法，而KASP技术作为SNP标记基因分型的一种，能够在保证基因分型准确性的情况下，大大节省实验所消耗的时间［6］。

在水稻方面，Cheon等［67］开发了771对KASP标记并成功地用于韩国温带粳稻品种的遗传图谱构建和抗病性及穗发芽抗性的QTL分析。其中，利用239对KASP标记对包含160个系的重组自交系（RIL）进行了抗穗发芽的QTL检测。Ghosal等［68］通过所构建的两个F2水稻群体，分别获得了170个和179个多态性SNPs，并将这些位点设计成KASP标记进行检测，共鉴定出5个分别位于染色体3、5、6、7和8上的与存活率有关的QTL，以及4个分别位于染色体1、3和7上的控制幼苗高度的QTL。有氧水稻生产（aerobic rice production，AP）是减少水稻栽培用水的有效方式，具有窄根锥角（narrow root cone angle，RCA）基因被认为是AP的一个关键特征。研究表明，qRCA4对于RCA变异起重要作用［69］。Vinarao等［70］构建了3种不同遗传背景的水稻F2群体，利用9对KASP标记（其中两对标记：snpOS00933和snpOS00944被设计用于QTL两侧，而另外7对标记被设计在QTL内），最终将qRCA4精细定位在720 kb的区域内。另外，Lei等［71］在7号染色体上检测到一个与相对地上部长度（RSL）相关的主效QTL：qRSL7，并根据亲本之间的SNP，在QRSL7附近开发了25对KASP标记，最终将QRSL7定位在222 kb的距离内。

在小麦方面，蒋钰婕等［72］用小麦无芒品种中国春为父本，有芒品系MK147为母本构建了F2分离群体，利用58对KASP标记将控制芒的QTL定位在0.81 cM的区间内。Zhan等［73］利用20对KASP标记对小麦品种T.ponticum × Taichung 29的F2分离群体，进行抗小麦白粉病基因PmCH7087的定位分析，最终将目标基因定位在9.68 Mb的区间内。Xiong等［74］利用突变体eh1和LX987杂交获得的RIL进行遗传作图，检测到37个与抽穗期、株高、千粒重、穗长等农艺性状有关的QTL，并利用成功开发的25对KASP标记对这些QTL进行了验证，从而将染色体4B和3A上的QTL分别限定在0.8 Mb和2.5 Mb的物理间隔内。通过将KASP技术与构建遗传图谱相结合，Wu等［75-76］分别利用17对和18对KASP标记在染色体2BS、3BS和6BL上鉴定了3个与抗条锈病性相关的QTL，并将6BL染色体上的QTL最终定位在KASP标记IWB71602和IWB55937之间，其遗传距离为1.4 cM。

在玉米方面，Nair等［77］利用KASP标记技术对CML206 × CML312的F2群体，进行玉米条纹病抗性基因Msv1的精细定位，定位区间为0.87 cM。玉米致死性坏死（maize lethal necrosis，MLN）是撒哈拉以南非洲地区玉米的一种主要疾病，严重感染时，产量损失可达 100%［78］。对此，Awata等［79］开发了500对可能影响MLN表型的KASP标记，通过对7个群体的F3后代进行分析，检测到了至少有7个抗MLN的QTL。其中，3号染色体上的2个SNP位 点（PHM15449_10和 PZA00920_1） 与 MLN抗性密切相关。此外，Wang等［80］在3号染色体上发现了与高茎秆断裂角度（影响茎秆的柔韧性和抗倒伏性）有关的2个候选基因：Zm00001d039769和Zm00001d039913，根据这2个候选基因设计的2对KASP标记，经过验证也显示出与茎秆断裂角度有显著的相关性。

在其它作物方面，Kante等［81］构建了西非高粱的 POPCD（CK60A × DT-298）、POPFD（FambeA ×DT-298）和 POPFL（FambeA × Lata）的 3 个 F2分离群体，鉴定了7个与育性恢复基因Rf相关的QTL，并利用开发的11对KASP标记在POPCD和POPFL的F2：3群体中进行了QTL位点的验证。Cheng等［82］通过遗传作图在6号染色体上检测到与大豆镰刀菌抗性有关的3个抗性候选基因，针对其中一个基因（Glyma.06g206900）设计了KASP标记并在不同遗传群体中进行了验证，发现该标记与病原菌反应之间存在着很强的相关性。提高水分利用效率可以有效减少干旱胁迫造成的生产损失，为了确定苹果中与调控水分利用效率有关的位点，Wang等［83］利用Honeycrisp和Qinguan两个品种构建的F2群体进行了干旱胁迫QTL的鉴定，随后用开发的3个KASP标记对其中的3个QTL进行了稳定性验证。Scholten等［84］利用1 100对KASP标记对所构建的洋葱种间三交群体进行基因分型，最终将鳞状葡萄孢杆菌（botrytis squamosa）的抗性位点定位于6号染色体上。此外，KASP技术还被用于大白菜［85］、花生［86］等农作物在遗传图谱构建与基因定位中的研究。

2.4 KASP技术在种子纯度鉴定中的应用

传统上对种子纯度的鉴定主要依赖于表型鉴定，效率低下。随着DNA分子标记技术的不断发展，越来越多的作物开始使用不同类型的分子标记来鉴别种子的真伪和纯度［87］，但AFLP、SSR、InDel等标记存在数量少、操作复杂等不足。而SNP标记具有稳定性好、密度高、分布广泛、适于规模化筛选等优点，已被应用于辣椒、黄瓜等作物的品种鉴定以及种子纯度检测等方面［88-90］。目前KASP标记技术在种子纯度鉴定方面也得到了越来越多的应用（表1）。

表1 KASP技术在主要农作物中的应用Table 1 Application of KASP technology in crops

Ertiro等［91］使用了191对KASP标记和257 268对GBS（genotyping by sequencing，通过测序进行基因分型）标记对来自玉米品种的16个自交系的2-9个种子源的遗传纯度和同一性水平进行了评价分析。研究结果表明基因分型平台的类型和用于分析的标记数量对于不同来源的种子纯度及同一性方面均存在一定差异，但两种方法得出的总体结论基本相似。说明相较于高标记密度的GBS技术，使用低标记密度的KASP技术就可轻松完成材料的质控分析。此外，尹祥佳等［92］采用KASP技术对甘肃省内推广的6份玉米杂交种进行了纯度鉴定，结果显示4对KASP标记对品种的纯度鉴定结果在95.83%-98.96%。王蕊等［93］筛选获得在玉米染色体上分布均匀、多态性较好的60个候选位点，并转化为KASP标记，转化成功率为95%。综合考虑标记双亲互补率、多态性、稳定性和分型效果等多项指标，最终确定20个标记作为玉米杂交种纯度鉴定的核心标记，这些标记能够有效鉴定99.7%供试样品纯度。冯子珊等［94］利用3对KASP标记对短棒瓠瓜杂交种的92份F1及其父、母本材料进行了分析，结果显示F1种子纯度为97.8%，与田间种植纯度鉴定结果一致。匡猛等［95］利用棉花63K全基因组SNP芯片对代表性品种进行了筛选与综合评估，并基于KASP技术开发了一套适用于我国棉花杂交种纯度高通量检测的核心SNP组合（合计26个），从而实现了对大量样品的品种纯度的快速检测。为了确定大麦预混麦芽样品“麦特卡夫”的样品纯度，蒋培基等［96］筛选鉴定了4个能够区分7个大麦麦芽品种的SNP位点，开发了对应的KASP标记。进一步的分析表明这些标记能够成功分辨出预混麦芽样品。此外，Kim等［97］使用50对KASP标记在102个萝卜自交系中进行品种纯度验证发现，这些自交系的纯合性在56%-96%。

3 展望

随着分子生物学和高通量测序技术的发展，越来越多的农作物品种和品系的基因组重测序使得SNP标记日益丰富。基于这些丰富的SNP数据，以SNP芯片阵列和重测序SNP分型技术为主的基因分型平台得到了快速发展［98-99］。KASP作为目前主要的SNP分型检测技术之一，相较于传统的分子标记（RFLP，STS、SSR等）有其独特的优势［7，100］。它是一种简单的无凝胶荧光聚合酶链式反应，能够在普通实验室操作的基础上满足低、中、高通量基因分型的要求，具有一定的灵活性，适用于目标位点和样本数量变化很大的实验设计。此外，相较于其他的SNP基因分型平台如：TaqMan和Illumina GoldenGate，它又能很大程度上降低实验成本以及提高实验准确率。该技术目前已在农作物分子标记辅助育种、种质资源鉴定、遗传图谱构建和种子纯度鉴定等领域得到了广泛的利用。

从分子标记的利用看，传统的SSR等标记仍然是大多数研究者常用的标记技术［101］。究其原因，虽然现有SNP数据非常丰富，但是这其中包括了大量冗余信息，研究人员很难快速准确的获得有用的SNP信息。其次，大量的SNP信息还难以与功能基因位点关联，这限制了其在以功能基因利用为主的遗传育种中的应用［19］。就技术本身而言，由于SNP位点的限制，在KASP引物设计时会受到SNP附近序列的限制而造成所设计的引物无法有效进行PCR扩增［14］。此外，模板DNA质量的高低对于KASP检测成功率也有重要影响。因此，为了提升KASP技术的利用效率，在基础研究领域应当注重基因功能位点的收集和汇总，建立相关功能基因多态性位点的KASP数据库。为提高KASP对未知样本的检测效率，在开发功能性KASP标记的同时，应当建立相配套的阳性对照标准品。从KASP技术的具体操作来看，实验室小规模检测条件下应当保证模板DNA的质量并调整到相似的浓度。当前分子设计育种已经被作为一项高效和精准的育种技术手段，而在多种作物中被提出和实施。随着功能基因序列信息的积累和KASP分子标记数目的增加，该技术将成为种质资源鉴定、群体分析和分子设计育种等研究的重要辅助手段。