水生栖热菌漆酶TaLac的性质分析及对孔雀石绿染料的脱除

毛国涛 王杰 王凯 王方园 曹乐言 张宏森 宋安东

（河南农业大学生命科学学院，郑州 450002）

漆酶（laccase，EC 1.10.3.2）属于蓝色多铜氧化酶家族，可氧化多种酚类和非酚类化合物，同时将氧气还原为水，无其他副产物的生成［1-2］。漆酶含有保守的组氨酸残基，结合4个铜原子，参与底物的氧化［2-3］。由于其底物的宽泛性和绿色催化特性，漆酶被广泛应用于纸浆的漂白、生物质的预处理、酚类污染物的降解以及合成染料的脱色和脱毒等方面［3-5］。孔雀石绿（malachite green，MG）是一种人工合成的三苯甲烷类化合物，广泛应用于纺织品、皮革、纸张等的染色，以及鱼类真菌、寄生虫等感染的防治［6］。但MG具有致畸、致癌、致突变等毒害作用，MG的滥用和排放严重威胁人类健康［7］。研究表明漆酶可有效降解MG，使MG脱色，显著降低MG对微生物、植物和动物等的毒害作用［8-10］。

漆酶广泛存在于植物、动物、细菌和真菌中，其中细菌漆酶因其易重组表达、良好的温度耐受性而受到越来越多的研究［3］。2006年，一个新的细菌漆酶家族DUF152被鉴定出来［11］。该家族漆酶的分子量约为30 kD，远小于经典漆酶（60-100 kD）；且DUF152家族漆酶中不含有保守的经典漆酶铜原子结合位点［11］。但 DUF152 家族漆酶对 2，2′-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉 -6-磺酸）（2，2′-azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）、2，6-二甲基苯酚（2，6-dimethylphenol，DMP）等经典漆酶底物具有催化活性［11-13］。已鉴定DUF152家族漆酶RL5、Tfu1115、LaclK均具有优异的热稳定性，且能够降解多种合成染料如乙基紫、碱性蓝B和亚甲基蓝［11-13］。DUF152家族漆酶对MG的脱色和脱毒性质仍待进一步探究。本研究通过在大肠杆菌过量表达来源于水生栖热菌（Thermus aquaticus）的DUF152家族漆酶TaLac，利用Ni亲和层析法纯化得到高纯度的TaLac蛋白，表征TaLac的最适pH、最适温度等酶学性质，探究TaLac对MG脱色和脱毒的能力，为构建MG污染水体的生物修复体系提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒与菌株 表达载体pET-28a（+）、大肠杆菌BL21（DE3）为河南农业大学能源微生物实验室保存。

1.1.2 主要试剂 酵母提取物和胰蛋白胨购于英国OXID公司；卡那霉素、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-Thiogalactoside，IPTG）、NaH2PO4、Na2HPO4、咪唑、醋酸、NaNO3和三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）均购于索莱宝（北京）科技有限公司，分析纯；Ni亲和介质购于德国Qiagen公司；限制性内切酶Nde I和Xho I购自美国NEB公司；ABTS、DMP、愈创木酚（guaiacol）、L-多巴胺（L-dopamine，DPA）和丁香醛连氮（syringaldazine，SGZ）等购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 TaLac的生物信息学分析 用ExPASy在线服务器ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）工具分析TaLac蛋白的基本性质；利用Clustal Omega对TaLac与同源蛋白进行序列比对［14］；利用Swiss Model预测 TaLac的三级结构［15］。

1.2.2 重组表达载体pET28a-TaLac的构建 编码TaLac（WP_003046852.1）蛋白的基因经南京金斯瑞生物科技有限公司优化后合成。以5′-AATCTCACCA TGGGCATGGTTCCGCTGCTGACC-3′和 5′-AATCTCA CTCGAGGCCGTGGCTCAGCGCCAGC-3′为引物扩增TaLac基因，利用Nco I和Xho I限制性内切酶处理后，连接至pET-28a（+），构建重组表达载体pET28a-TaLac。TaLac基因经DNA测序进行验证。

1.2.3 TaLac的重组表达及纯化 pET28a-TaLac转化至BL21（DE3），挑取单克隆在含有25 mg/L卡那霉素的LB培养基中37℃震荡培养至OD600为0.8时，加入0.5 mmol/L的IPTG于16℃震荡培养12 h。离心收集菌体，使用裂解缓冲液（20 mmol/L磷酸盐缓冲液，pH 7.4）重悬菌体，经高压破碎后，14 000×g离心30 min，收取上清。上清液流穿Ni亲和层析柱，洗杂缓冲液（20 mmol/L磷酸盐缓冲液，40 mmol/L咪唑，pH 7.4）流穿Ni亲和层析柱，洗脱缓冲液（20 mmol/L磷酸盐缓冲液，300 mmol/L咪唑，pH 7.4）流穿Ni亲和层析柱洗脱TaLac蛋白，利用截留值为10 kD的超滤管（美国Millipore公司）进行脱盐浓缩。通过SDS-PAGE分析TaLac的纯度，利用Bradford法测TaLac的蛋白浓度，TaLac蛋白分装冻存于超低温冰箱。

1.2.4 TaLac酶活力的测定 采用DMP对TaLac的活力进行测定。总体积为0.2 mL的反应体系中含有20 mmol/L乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 4.0）、1 mmol/L CuSO4、1 mmol/L DMP和适量的TaLac，于60℃反应10 min，测定其在468 nm波长处的吸光值［ε420=148 000 L/（mol·cm）］，计算 TaLac的酶活力。1 min内氧化1 μmol 底物所需的酶量定义为1个酶活力单位（U）。

1.2.5 温度和pH对TaLac酶活力的影响 在乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 3.0-6.0）、Tris-HCl缓冲液（pH 7.0-9.0）等缓冲液条件下，以DMP为底物，于60℃测定TaLac的酶活力，以得到的最高酶活力处的pH为TaLac的最适pH。

在乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 4.0）条件下，以DMP为底物，于30-80℃测定TaLac的酶活力，以得到最高酶活力处的温度为TaLac的最适温度。

分别将TaLac在50和60℃条件孵育一定时间后，以DMP为底物测定TaLac的残余酶活力。以未经热处理TaLac的酶活力为100%。

1.2.6 金属离子对TaLac酶活力的影响 在20 mmol/L乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 4.0）中，分别添加不同浓度的CuSO4，以DMP为底物，于60℃测定TaLac的酶活力，确定Cu2+对TaLac的酶活力的影响。

在20 mmol/L乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 4.0）、1 mmol/L CuSO4缓冲液中，分别添加10 mmol/L MgCl2、CaCl2、MnCl2、ZnCl2、BaCl2和 1 mmol/L EDTA，以DMP为底物，于60℃测定TaLac的酶活力，确定不同金属离子对TaLac的酶活力的影响。以不添加其他金属离子和EDTA时TaLac的酶活力为对照（Ctrl）。

1.2.7 TaLac动力学参数的测定 于60℃测定TaLac在0.1-5.0 mmol/L DMP条件下的酶促反应速率，利用GraphPad Prism8软件计算动力学参数Km和kcat。

1.2.8 TaLac的底物特异性 在20 mmol/L乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 4.0）、1 mmol/L CuSO4缓冲液条件下，于60℃测定TaLac对ABTS［ε420=38 000 L/（mol·cm）］、SGZ［ε530=64 000 L/（mol·cm）］、guaiacol［ε470=26 600 L/（mol·cm）］和 DPA［ε300=2 835 L/（mol·cm）］的酶活力。

1.2.9 TaLac对MG的脱色 在20 mmol/L乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 4.0）、1 mmol/L CuSO4缓冲液中，加入0.8 mg/L TaLac和50 mg/L MG染料，分别在添加ABTS和不添加0.1 mmol/L ABTS的情况下，于60℃反应一定时间后，测定反应体系在617 nm处的吸收值。以未添加酶液的反应体系为对照，计算TaLac对MG的脱色率：脱色率（%）=（A0-A）/A0×100%，其中A0为未添加酶液反应体系的OD值，A为添加酶液反应体系的OD值。

1.2.10 MG的脱色产物的毒性评价 50 mg/L MG经TaLac于60℃处理3 h后，pH调整为7.0以减少对玉米萌发的影响。将玉米种子分别置于含有ddH2O（对照组）、未经TaLac处理的MG以及经TaLac处理后的MG脱色产物的保温盒中，于25℃下避光培养5 d，记录玉米种子发芽情况，测定胚芽和胚根的长度。

1.2.11 数据分析 文中相关实验至少重复3次，相应数值使用平均值±标准偏差表示，使用Excel进行数据统计。

2 结果

2.1 TaLac的生物信息学分析

TaLac具有244个氨基酸残基，理论分子质量为26.1 kD，理论等电点为7.1。序列比对结果（图1-A）显示，TaLac与已研究DUF152家族成员RL5、Tfu1114和LaclK的序列一致性分别为27.6%、36.5%和23.5%。TaLac具有DUF152家族保守的氨基酸残基，如可能的铜原子结合位点H66、C100和H116（图1-A）。TaLac的结构模型显示，TaLac与结构已解析的DUF152家族成员GsYlmD具有相似的三级结构（图1-B）。

2.2 TaLac的克隆、表达及纯化

重组质粒pET28a-TaLac表达的TaLac蛋白C末端带有6×His标签，可利用Ni亲和层析法进行纯化（图2）。TaLac在BL21（DE3）中呈可溶性表达形式。在SDS-PAGE显示，纯化后的TaLac蛋白处于25-30 kD之间（图2-B）。TaLac经Ni亲和层析法纯化后纯度可达到95%以上，满足后续酶活性分析要求。

图2 TaLac的克隆及纯化Fig.2 Cloning and purification of TaLac

2.3 TaLac的酶学性质

2.3.1 温度和pH对TaLac活力的影响 TaLac可氧化漆酶的经典底物DMP。以DMP为底物，测定TaLac催化的最适条件。结果（图3-A、B）表明，TaLac的最适pH为5.0，最适温度为60℃。TaLac在50℃和60℃分别处理4 h后，仍保留原始活力的80%和52%（图3-C）。

图3 pH和温度对TaLac活力的影响Fig.3 Effects of pH and temperature on the activity of TaLac

2.3.2 TaLac的动力学和底物特异性分析 以DMP为底物，最适条件下测得TaLac的动力学参数Km为0.74 mmol/L，kcat为1.61/min（图4-A）。除了可以氧化DMP外，TaLac还可以DPA和愈创木酚为底物；但TaLac不能催化以ABTS和SGZ为底物的氧化反应（图4-B）。

图4 TaLac的底物特异性（A）和对DMP的动力学参数（B）Fig.4 Substrate specificity of TaLac（A）and kinetic parameters against DMP（B）

2.3.3 金属离子对TaLac活力的影响 在体系中没有Cu2+时，TaLac完全失去催化活性；在1、2和5 mmol/L Cu2+条件下，TaLac能够发挥最大酶活力；当Cu2+浓度升高至10 mmol/L时，TaLac部分活性被抑制（图5）。当EDTA螯合去除溶液中Cu2+后，TaLac失去催化活力（图6）。

图5 TaLac活力对Cu2+的依赖Fig.5 Dependence of TaLac activity on Cu2+

如图6所示，在10 mmol/L二价金属离子Mg2+、Ca2+、Mn2+和Ba2+的作用下，TaLac的活力提高至原有活力的120%-135%，说明这些金属离子可以提高TaLac的活力；而在10 mmol/L Zn2+的影响下，TaLac可发挥92%的酶活力。

图6 金属离子对TaLac活力的影响Fig.6 Effects of metal ions on the activity of TaLac

2.4 TaLac对MG的脱除

2.4.1 ABTS对TaLac脱除MG的影响 由图7可知，在无介体辅助的情况下，TaLac在4 h对50 mg/L MG的脱色率可达67%。而在ABTS介体的作用下，TaLac在0.5 h时对MG的脱色率为58%，2 h时脱色率达到90%，在3 h即可对MG完全脱色。

图7 TaLac催化MG的脱色Fig.7 Decolorization of MG catalyzed by TaLac

2.4.2 MG脱色产物的毒性评价 利用玉米萌发实验评价TaLac脱除MG后产物的毒性。如表1所示，未经TaLac处理的50 mg/L MG组的玉米发芽率、胚芽长度和胚根长度显著低于对照组。经TaLac处理的MG脱色产物组玉米的发育率为100%、胚芽长度为1.55 cm、根长为5.25 cm，与对照组相比无显著差异（表1）。

表1 MG及其脱色产物的植物毒性实验Table 1 Phytotoxicity test of MG and MG decolorized products

3 讨论

印染行业是我国的传统支柱产业，我国每年染料的生产量可达90余万t［16］。由于染料利用效率低下，致使超过11%的染料被排入印染废水中［17］。由于染料结构稳定、色度高、毒害作用大，导致印染废水难以处理。印染废水的肆意排放，会严重抑制水体生物的生长发育；并且，有毒有害染料在水产及农作物中的富集，严重威胁人体的健康［7，18-20］。漆酶可有效降解染料，降低其毒害作用，在印染废水的绿色处理中具有巨大的应用潜力。因此，新型漆酶的挖掘及鉴定具有重要的理论意义和应用价值。

本研究在嗜热菌水生栖热菌中挖掘到DUF152家族成员TaLac，该蛋白分子量为26.1 kD，与已鉴定DUF152家族漆酶成员大小相当，均远小于经典漆酶的分子量［11-13］。TaLac与已鉴定DUF152家族漆酶的同源性在23%-36%，具有家族内保守的铜原子结合位点和相似的高级结构，极有可能是具有催化活性的DUF152家族漆酶。

TaLac在大肠杆菌中过量表达，利用Ni离子亲和层析1步纯化即可得到高纯度的TaLac蛋白。TaLac可氧化愈创木酚、DPA和DMP，验证了生物信息学的分析结果；而同家族的LaclK只能够氧化DPA和DMP，不能够催化愈创木酚的氧化反应［13］。TaLac对DMP底物的动力学参数Km为0.74 mmol/L，与同家族的LalK（0.46 mmol/L）、Tfu1114（1 mmol/L）相当［12-13］。来源于嗜热菌的TaLac具有较好的热稳定性，在50℃孵育4 h后，活性保留80%；60℃孵育4 h后，活性保留52%。不同来源漆酶的热稳定性差异较大。一色齿毛菌（Cerrena unicolor）漆酶LacT-1在50℃处理1 h后仅保留40%活性，60℃处理1 h后失去全部活性［21］。地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）ANSB821漆酶CotA分别在50和60℃热处理2 h后，活力仅剩余40%和30%［22］。TaLac良好的热稳定性与其水生栖热菌的来源相关。水生栖热菌来源的Taq DNA聚合酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶等均具有极高的耐热性［23-24］。

10 mmol/L Zn2+仅使TaLac活力降低8%，而10 mmol/L Mg2+、Ca2+、Mn2+和Ba2+则不同程度地促进TaLac的活力，表明TaLac可耐受高浓度的二价金属离子。Cu2+对于漆酶的催化反应是必需的。TaLac的活性严格依赖于Cu2+。在没有Cu2+时，TaLac没有漆酶活性；0-5 mmol/L Cu2+促进TaLac的活性；10 mmol/L Cu2+则抑制了TaLac的活性。该结果表明，Cu2+参与了TaLac对DMP的氧化反应，即TaLac与Cu2+具有相互作用。但TaLac与已鉴定DUF152家族中可能的Cu2+结合位点不同于经典漆酶［11-13］。电感耦合等离子体质谱实验表明每个RL5分子可能结合4个铜原子，但Tfu1114与LaclK的研究表明每个漆酶分子结合1个铜原子［11-13］。Cu2+与DUF152家族漆酶的结合比例与相互作用方式仍不清晰，有待进一步研究。定点突变与等温滴定量热法的结合，可以确定TaLac与Cu2+的结合比例、结合位点等信息；TaLac与Cu2+高级结构的解析，能够更进一步阐明Cu2+在DUF152家族漆酶催化反应中的作用，解释该家族漆酶的催化机制是否与经典漆酶一致。

MG大量应用于印染等工业，其无序排放对自然环境、动植物乃至人类形成巨大的威胁。热稳定性好、金属耐受性高的TaLac在条件复杂的MG废水中具有应用潜力。实验表明，TaLac可高效脱除MG。TaLac于60℃在4 h内对MG的脱色效率达到67%。介体的加入，可提高漆酶对污染物的降解效率［2，25］。在ABTS的辅助下，TaLac可于3 h内完全脱除MG。同样在ABTS的参与下，LaclK在1 h内对9 mg/L MG的脱色效率不足40%［13］；一色齿毛菌漆酶LacT-1在12 h内对MG的降解效率为95%［21］。同温层芽孢杆菌BCMC2漆酶BaCotA对MG仅具有微弱的降解活性；而在ABTS存在时，BaCotA于3 h可降解82% MG［26］。值得注意的是，TaLac和LaclK均不能催化ABTS的氧化，但ABTS却能加速TaLac和LaclK对MG的脱色反应［13］。该现象无法使用经典的漆酶介体系统机制进行解释，可能与DUF152家族漆酶的催化机制相关，需要进一步的研究。MG经TaLac处理后颜色的高效脱除，表明MG的生色基团受到破坏。因此，TaLac可能与白腐真菌齿毛菌（Cerrena sp.）漆酶LacA、棘孢木霉（Trichoderma asperellum）漆酶等经典漆酶一致，通过氧化作用等降解MG，进而实现MG的脱色［10，27］。TaLac对MG的具体降解途径仍待液相色谱质谱联用等方法进一步的确定。

漆酶对MG的降解是否可以脱除MG的毒性，需要进一步的研究。本研究利用玉米萌发实验评价MG脱色产物的毒性，该方法也被用于评价活性黑5染料的毒性［28］。MG组中玉米种子的发芽仅为33%，且发芽种子的胚芽及胚根长度显著低于对照组，表明MG对玉米发芽及生长的严重抑制作用。经TaLac处理后的MG组中玉米的发芽及生长基本不受抑制，说明TaLac完全消除了MG对玉米的毒害作用。然而，MG经LacA漆酶处理后毒性虽然显著降低，但仍对烟草、莴苣的生长有一定的抑制作用［27］。综上，TaLac可对MG进行高效脱色及脱毒。

4 结论

在嗜热菌水生栖热菌筛选到具有漆酶活性的DUF152家族成员TaLac。TaLac具有DUF152家族保守的铜原子结合位点，有较好的温度稳定性，且能够耐受高浓度的 Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+和 Ba2+等金属离子。在ABTS介体的辅助下，TaLac可在3 h完全脱除50 mg/L MG，并且TaLac的处理彻底消除了MG对玉米的毒害作用。因此，DUF152家族漆酶TaLac在MG污染水体的修复中具有应用潜力。