高直链淀粉禾谷类作物种质创新与利用研究进展

徐妙云 邢利娟 杨明雨 张凌萱 王磊 刘悦萍

（1.中国农业科学院生物技术研究所 农业部农业基因组学重点实验室（北京），北京100081；2.北京农学院生物与资源环境学院，北京102206）

随着居民生活水平的提高，因营养失衡引发的慢性病高发问题日益严重，《2018全球营养报告》［1］指出，全球有1/5的死亡与饮食有关。该报告首次强调了饮食在消除营养不良方面的重要性。全球194个国家和地区每年因营养性疾病损失3.5万亿美元，而超重和肥胖花费5 000亿美元。中国青少年虽然营养不良发生率大幅下降，但超重和肥胖的比例大幅增加。同时中国成人糖尿病、超重和肥胖比例也大幅升高。在接下来的几年里，需要引导人们培养健康的生活习惯，以期在2025年达到超重、肥胖、“三高”的零增长率目标［2］。因此从食物源头供给上进行改变，依据营养需求安排农产品供给，开发具有营养和保健功能的食品尤为重要。

淀粉（starch）作为世界上绝大多数人口的主食，在人类生活中起着举足重轻的作用。根据多糖链的形式，淀粉分为直链淀粉（amylose）和支链淀粉（amylopectin）。根据其在人体中的消化吸收方式不同，淀粉可分为可消化淀粉（digestible starch）、慢消化淀粉（slowly digestible starch）和抗消化淀粉（resistant starch，RS）。抗消化淀粉又称为抗性淀粉，是指在健康人体的小肠中不能被分解吸收，而在大肠中可被酵母菌发酵分解的淀粉。RS有良好的生理功能，可应用于高膳食纤维、低血糖指数功能性食品的加工和开发。RS含量与直链淀粉所占的比例显著相关［3-4］。因为直链淀粉具有很好的凝胶强度，回升值较高，可以形成塑性较好的薄膜，作为重要的工业原料，用途广泛，涉及到各个领域，如医疗、造纸、包装、石油、环保、光纤、服装等行业。同时，直链淀粉持水力低、吸水性差、可膨化、糊化温度高、热量低等特点，适合用于食品直接加工或作为食品添加剂［5］。就玉米而言，全世界淀粉年产量为3 600万t，其中80%以上是玉米淀粉，但是普通玉米的直链淀粉含量20%-25%，从普通玉米提取直链淀粉成本很高；对水稻和小麦而言，通过提高淀粉中直链淀粉的含量来提高RS的比例，进而可以开发适合慢性病人的食物，因此加强高直链淀粉玉米和水稻、小麦育种具有重要的社会效益和经济效益。本文将对参与玉米和水稻等禾谷类作物胚乳中淀粉合成代谢的酶类、淀粉的生物合成途径、直链淀粉提高的途径，以及目前已经选育成功的高RS水稻、小麦和高直链淀粉玉米的推广情况等进行综述，并展望该领域今后可能的发展。

1 淀粉概述

淀粉以半结晶颗粒的形式存在于谷物或者豆类种子胚乳或植物的各种器官中。目前已知其常见的储藏器官主要是种子（水稻、小麦、玉米、高梁、大麦、燕麦等），块茎（马铃薯、菊苣、山药等），块根（甘薯、木薯等），未成熟的果实（香蕉和芒果），以及叶片（拟南芥、藻类等）。淀粉颗粒形状有圆形、椭圆形、扁豆形和多角形等，大小范围在1-100 μm之间。淀粉是由数百上千的单糖分子连接聚合而成的多聚体，是一种多糖。直链淀粉是D-葡萄糖基以α-（1，4）糖苷键连接的多糖链，分子中有200个左右葡萄糖基。虽然直链淀粉是线性的，但是其依然存在部分分支，大分子量的直链淀粉分子可能具有多达10个或更多分支，不过分支一般相对较短。支链淀粉分子中除有α-（1，4）糖苷键的糖链外，还有α-（1，6）糖苷键连接的分支，分子中含300-400个葡萄糖基。淀粉由15%-25%的线性直链淀粉、高度分枝和组织化的支链淀粉组成［6］。

淀粉合成主要在植物叶片的叶绿体和储藏组织的淀粉体中进行。在叶绿体中，白天通过光合作用，将CO2固定为淀粉，作为临时性储藏物，夜间将淀粉分解，以蔗糖的形式运输到其它各个组织中。在储藏器官中蔗糖重新转化为淀粉，淀粉粒作为长期储藏形式积累在淀粉体中，大部分在种子萌发和幼苗生长时期被分解，提供萌发和生长所需的能量。

2 参与禾谷类作物胚乳中淀粉合成代谢的主要酶类

叶绿体和淀粉体均是淀粉合成的主要场所，前者通过光合作用合成淀粉，淀粉合成初期以临时性淀粉形式存储在叶片中，随后淀粉降解产生的蔗糖经韧皮部运输至胚乳。在胞液中经蔗糖合成酶（sucrose synthase）催化分解为果糖和UDP-葡萄糖（UDPG），UDPG转化为6-磷酸葡萄糖（Glu-6-P）或1-磷酸葡萄糖（Glu-1-P）。Glu-6-P或Glu-1-P转运进入淀粉体中，经ADP葡萄糖焦磷酸酶（ADP glucose pyrophosphorylase，AGPase）作用生成合成淀粉的底物腺苷二磷酸葡萄糖（adenosine diphosphate glucose，ADPG）。

淀粉的合成是一个复杂的生化调控过程，需要多种酶共同参与，主要有五大类酶，分别是AGPase、淀粉合成酶（starch synthase，SS）（包括颗粒束缚淀粉合成酶（granule-bound starch synthase，GBSS）和可溶性淀粉合成酶（soluble starch synthase，SSS））、分支酶（starch branching enzyme，SBE）和脱分支酶（debranching enzyme，DBE）。各种酶既发挥独特的作用，部分酶彼此之间又相互作用，并存在功能冗余现象。虽然禾谷类作物胚乳中淀粉合成途径都主要是这五大类酶分工合作，但在进化过程中，不同作物中每种酶又不尽相同，功能也各异，这里以玉米和水稻胚乳中迄今发现的酶类为例进行阐述，并根据目前的研究，列出了水稻和玉米淀粉合成的异同（图1）。

2.1 ADP葡萄糖焦磷酸酶AGPase

AGPase催化淀粉合成途径中第一个关键的调控步骤，植物AGPase是同源四聚体，由两个大亚基（large subunit，LSU）和两个小亚基（small subunit，SSU）组成［7］。此处，水稻中发现有Pho1以温度依赖型的方式参与淀粉的合成，pho1水稻突变体中聚合度（degree of polymerization，DP）为11的短链比例高，而DP13-21中等长度的链比例低，另外，在Glu-1-P存在的情况下，Pho1可以将DP4-6的麦芽低聚糖合成长链［8］，所以，在水稻的淀粉合成途径中，Pho1在长链糖原的合成中发挥重要作用，但是Pho1基因仅在籽粒发育早期显著高表达。而玉米和大麦中还没有发现pho1突变体（图1）。

2.2 淀粉合成酶SS

淀粉合成酶的功能是将葡萄糖残基加到引物的非还原端延长葡聚糖的线性糖链。到现在为止，玉米胚乳中鉴定了多个淀粉合成酶异构体，有GBSS，SSI，SSII，SSIII 和 SSIV［9］（ 图1）。 水 稻有2个颗粒结合型淀粉合成酶异构体（GBSSI和GBSSII），和10个可溶性的淀粉合成酶异构体，1个SSI，3个SSII异构体（SSIIa/SSII-3，SSIIb/SSII-2和SSIIc/SSII-1），2个SSIII 异构体（SSIIIa/SSIII-2和SSIIIb/SSIII-1），以及 2个 SSIV 异构体（SSIVa/SSIV-1和 SSIVb/SSIV-2）［10-12］（图1）。GBSS 与淀粉粒结合紧密，主要负责直链淀粉的合成。水稻、玉米和小麦中，Waxy（wx）基因编码GBSSI，wx突变体胚乳总淀粉含量变化均不明显，但AC含量显著减少或者完全缺失［13-15］。研究表明GBSS除参与直链淀粉的合成外，也参与到支链淀粉中超长链（extra long chains，ELC）的合成［16］。SS或是溶于细胞质基质，或是呈半溶解半偶联于淀粉粒的状态，参与支链淀粉的合成。每一个亚型的 SS 在支链淀粉的合成中有着各自独特的功能。一般认为SSI可参与合成较短的葡糖链（DP8-12），没有异构体，SSI缺失突变体的种子和淀粉颗粒大小、形态均没有明显变化，说明有其他SS可以互补SSI的功能［17］；SSII负责中等长度的支链合成（DP13-25），玉米sugary（su2）突变体缺失SSII，导致中等长度的链减少而短链显著增加［18］，但是玉米和水稻SSIIa突变体的淀粉含量和淀粉粒形态没有显著变化［18-19］；SSIII可能参与长链的合成，并且与SSII存在一定相互作用，也有可能补偿部分SSIV的作用，水稻SSIIIa缺失突变体淀粉粒排列稀疏，胚乳粉质化，白心［20-21］，而玉米突变体也由于淀粉颗粒形态异常而呈现胚乳玻璃状无光泽的表型［22］，说明支链淀粉短链的变化对淀粉颗粒形态没有显著影响；SSIV 可能参与淀粉粒的起始合成，控制淀粉粒的数目，水稻中有两个SSIV基因SSIVa和SSIVb在灌浆阶段持续表达，说明SSIV也参与了淀粉的合成过程，但目前还没有禾谷类SSIV突变体被鉴定。

图1 水稻和玉米中直链和支链淀粉的合成途径Fig.1 Synthesis pathways of amylose and amylopectin in rice and maize

2.3 分支酶SBE

SBE将现有的α-1,4 糖苷键切断，然后将含6个或更多的葡萄糖残基的糖链转移至另外的或同一葡萄糖链上的 C6 位置上，可以引入直链与支链的分支点。目前在水稻和玉米中各发现了3个SBE基因（图1），SBE基因分为两个亚型：SBEI和SBEII，这两类基因编码的分支酶在支链淀粉合成中有着独特的作用，SBEI倾向于产生DP大于16的长链，而SBEII则倾向于产生DP小于12的短链。双子叶植物只有一种SBEII，而单子叶则有两种异构体SBEIIa和SBEIIb。SBEIIa在植物所有组织中都表达，而SBEIIb只在胚乳中特异表达。玉米和水稻SBEIIa突变体中支链淀粉的链分布模式没有明显变化，而玉米SBEIIb突变体中直链淀粉显著增加［23］，说明SBEIIb特异的参与支链淀粉中短链的形成，而SBEIIa可能有部分冗余功能。最新对sbeIIb水稻功能缺失突变体的研究发现，sbeIIb水稻除了直链淀粉含量从19.6%提高到27.4%，抗性淀粉含量从0.2%提高到17.2%外，许多编码AGPase，可溶性淀粉合成酶和其他淀粉分支酶异构体的基因均上调表达，而编码颗粒束缚淀粉合成酶、去分支酶、普鲁兰酶和淀粉磷酸化酶下调表达。同时，胚乳中糖、脂肪酸、氨基酸和植物甾醇含量均增加，表明淀粉合成途径对其他初级和次级代谢物的积累都产生了较大影响［24］。

2.4 去分支酶DBE

去分支酶也称为α-1，6-葡聚糖水解酶，它的作用是清除错误的分支点，使得支链淀粉形成易于结晶的螺旋结构，是决定淀粉结构形成的一个关键酶。目前在水稻中报道了4个DBE基因，玉米2个DBE基因（图1）。DBE分为两类：异淀粉酶（isoamylase，ISA）和普鲁兰酶（pullulanase，PUL）。ISA主要对可溶性的植物糖原和支链淀粉进行去分支，而PUL主要作用于普鲁兰糖和支链淀粉，但不作用于植物糖原。目前鉴定到植物中至少有3个ISA基因，但只有1个PUL基因［25］。

3 提高禾谷类作物中直链淀粉含量（amylose content，AC）的途径

目前提高禾谷类作物胚乳中AC主要是通过对淀粉合成途径中3个环节的关键酶基因进行改良来实现：一是提高AGPase的活性，从而增加底物ADPG的浓度［26-31］；二是提高GBSSI的表达，但因糖链的还原性末端有限，并且直链淀粉与支链淀粉二者之间存在底物竞争，导致AC达到一定水平后就不再上升［25-27］；三是降低SBEs，SSIIa，或者参与支链淀粉合成的其他酶类［28-30］。

3.1 通过提高AGPase的活性来增加胚乳中直链淀粉含量

水稻中，AGPase基因家族包括两个SSU基因，OsAGPS1和 OsAGPS2，4个 LSU基 因，OsAGPL1，OsAGPL2，OsAGPL3 和 OsAGPL4［26-28］。玉米中迄今为止，鉴定了分别编码胚乳特异性的LSU和SSU亚基 shrunken2 和 brittle2 基因［29-31］。过表达热稳定的玉米LSU（sh2r6hs）能够使水稻胚乳的淀粉含量提高23%［28］。同样，转玉米sh2r6hs基因的小麦种子中AGPase酶活性提高，每株种子重量平均提高38%，生物量提高31%［32］，同时促进光合作用和碳代谢［33］。在小麦胚乳中特异性表达TaLSU1基因可以显著提高种子中AGPase酶活性、胚乳中淀粉重量、穗粒数和单粒重［34］。

3.2 通过降低参与支链淀粉合成酶的活性来提高直链淀粉含量

SSIIa降低对胚乳中直链淀粉含量的改变因物种而异，例如SSIIa功能缺失的玉米突变体sugary2（su2）中直链淀粉含量可以从常规的25%-30%提高到40%-50%［18］，但是水稻中影响不大，SSIIa功能缺失的粳稻突变体胚乳中直链淀粉含量提高4%，与野生籼稻中含量相当［35］。而SSIIa功能缺失的小麦突变体籽粒皱缩，直链淀粉和抗性淀粉含量均提高，同时淀粉的可消化性降低［36-37］。分支酶活性降低或者完全丧失而产生的高直链淀粉水稻、小麦或者玉米株系，实际是因为支链淀粉的结构发生了较大变化，主要以长链分支为主［38-40］。支链淀粉的长链分支比例越高，直链淀粉含量越高［41］。

与降低SSIIa活性相比较，失活SBE的活性可以大幅度提高水稻、小麦和玉米中直链淀粉的含量。禾谷类作物中主要有3类SBE，分别为SBEI，SBEIIa和SBEIIb。研究表明，降低SBEI活性，对淀粉的成分和籽粒表型没有明显影响，只会引起籽粒中支链淀粉精细结构的微小变化［42-43］。SBEIIa基因缺失的水稻和玉米胚乳直链淀粉含量和支链淀粉的精细结构均没有明显的变化，但叶片中同化产物受到极大影响［10，44］。这可能是因为SBEIIa基因主要在叶片中特异性表达，因而不适合作为降低籽粒中支链淀粉含量的候选基因。而SBEIIb缺失（一般称为ae）突变体中直链淀粉含量能达到61.7%-67.7%，增加幅度35%［45］。水稻无论是粳稻还是籼稻，其ae突变体中直链淀粉含量均高于野生型，但是增加幅度最高15%，远远低于玉米ae突变体［38］。当SBEIIb与SBEI 在籼稻中组合突变后直链淀粉含量提高到了60%，显著高于SBEIIb单突变［46］。与水稻和玉米相反，抑制SBEIIb基因表达对小麦和大麦籽粒中直链淀粉含量影响不大［47］，而SBEIIa基因功能缺失的小麦和大麦突变体籽粒中直链淀粉含量分别提高到55%和38%［48-49］。

另外一种提高直链淀粉含量的有效方法是将SBEII单个突变与其他基因突变组合，例如缺失SSIIIa的水稻中直链淀粉含量为30.7%，将该突变引入SBEIIb缺失突变的背景中，双突变体的直链淀粉含量达到45%［50］。最新的研究报道了GBSSI基因野生型与SSIIa和SSIIIa等位基因发生突变的组合能使水稻籽粒中直链淀粉的含量提高17%［51］。

4 高直链淀粉禾谷类作物种质培育与推广应用

高直链淀粉水稻和小麦的应用价值，除了可作为食品添加剂之外，更重要的是直链淀粉含量的增加使水稻和小麦籽粒中抗性淀粉RS的含量提高。RS因为具有“控制餐后血糖及防止糖尿病、降血脂和控制体重、有利于肠道健康、抗消化及降低食物的热效应、促进钙镁锌离子的吸收”等重要生理功能，备受国内外营养专家和功能食品专家的重视，研制高RS谷物作物来防止人类慢性病的发展，成为了国内外育种和功能食品研究的新兴领域。市售水稻品种RS含量基本低于3%。2006年，浙江大学培育了首个高RS早籼稻突变体新品种：浙辐201，RS含量达3.6%［52］。该团队以主推杂交水稻恢复系R7954为起始材料，创制了突变体RS111，其热米饭中RS含量可达7%［53］。在此基础上，浙江绿巨人生物技术有限公司与浙江大学团队合作，开发了RS为8%以上的功能型水稻，2007年11月正式命名为“宜糖米”。同时，云南省农科院生物所与浙江大学团队合作开发了RS高达10%的功能型水稻功米3号，于2008年获得了新品种权，商品名为“适糖米”，并且根据不同人群的需求，开发了“适糖米普通型”和“适糖米加强型”。宜糖米和适糖米均为籼稻，目前在市场上都有销售。2010年，上海农科院利用花药培养技术和常规育种技术，在国内首次选育出较普通水稻品种RS含量高10倍以上的粳稻新品系：降糖稻1号，其RS含量超过13%。近年来，该团队以降糖稻1号为供体，利用分子育种技术，成功选育了功能性和高产优质兼顾的新高RS含量的水稻品系优糖稻2号和优糖稻3号。该系列商品名为“优糖米”，目前也在市场有销售。

小麦高抗性淀粉种质创新方面，2016年加利福尼亚大学戴维斯分校将SBEIIa基因的六倍体小麦Lassik EMS突变体和SBEIIb基因的Lassik EMS突变体进行杂交，获得了1个直链淀粉和抗性淀粉均大幅度提高的突变组合［54］。2020年，中国农业科学院作物科学研究所利用基因编辑技术，定点敲除冬小麦品种郑麦7698和春小麦品种Bobwhite中的SBEIIa基因，分别获得了高抗性淀粉的冬、春小麦新种质［39］，为培育营养功能型小麦新品种提供了新途径。

玉米方面，在20世纪70年代，用于商业生产高直链淀粉玉米杂交种有两种类型：C1assⅥ（含直链淀粉 50%）和 C1assⅦ（含直链淀粉 70%-80%）。到20世纪80年代时，Custom 农场种子公司推出直链淀粉含量超过 94%的 C1assⅧ和 C1assⅨ玉米单交种。我国以前没有高直链淀粉玉米品种，也没有高直链淀粉玉米种植和淀粉生产。经过多年的努力，中国农业大学国家玉米改良中心在国内率先培育出AC 达50%左右的高直链淀粉玉米中农大401。

5 展望

高直链淀粉水稻的选育工作虽然目前已经取得了一些不错的进展，也成功推广了几个商业化的产品，但是还存在产量低、垩白率高、加工性能和口感差、目标性状单一等问题，在今后的研究中可以在考虑改善农艺性状、提高加工性能的同时，向多目标复合性状方面发展。而我国高抗性淀粉小麦的种质创新工作刚刚起步，今后可以进一步利用基因工程技术和传统育种技术相结合，加快高抗性淀粉小麦、大麦的品种选育。

全世界淀粉年产量为3 600万t，其中80%以上是玉米淀粉，因此，加强高淀粉玉米育种具有重要的社会效益和经济效益。直链淀粉是重要的工业原料，用途广泛，涉及到各个领域，如食品、塑料、医疗等行业。但是普通玉米的直链淀粉含量20%-25%，从普通玉米提取直链淀粉成本很高。而相对于水稻，玉米的高直链淀粉选育工作要远远落后。目前，我国所需的直链淀粉主要依赖进口，价格昂贵。美国高直链淀粉玉米杂交品种的直链淀粉含量规定在50%以上。ae 基因的发现是玉米高直链淀粉育种的重要里程碑。该基因纯合体玉米胚乳中直链淀粉的含量从 25%增加到 70%。采用常规育种技术选育高直链淀粉玉米遇到的主要问题是玉米淀粉总含量减少，籽粒含水分量增高，最终产量降低。接下来的工作中要更注重于挖掘参与直链淀粉含量调控和修饰的基因，并阐明其分子机制。随着基因工程技术，以及各种淀粉特性分析技术的发展，相信不久的将来，我国高直链淀粉玉米的选育工作将会有所突破。