甘蔗单糖转运蛋白基因ShSTP7序列分析及组织表达特征测定

赵婷婷 王俊刚 王文治 冯翠莲 冯小艳 张树珍

（中国热带农业科学院热带生物技术研究所 农业农村部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室 海南热带农业资源研究院 海南省热带农业生物资源保护与利用重点实验室 中国热带农业科学院甘蔗研究中心，海口 571101）

甘蔗（Saccharum spp.）是禾本科C4植物，光合作用强，生物量高。甘蔗茎秆中积累大量的糖分，使其成为世界和我国重要的糖料及能源作物。甘蔗中光合作用合成的糖分从源到库的长距离运输、糖分在细胞内的分配及茎秆中的积累决定着甘蔗的产量及品质［1］。甘蔗中糖分从源到库的运输、分配、积累过程中涉及多次跨膜运输，糖转运蛋白在这个过程中扮演重要角色［1］。研究甘蔗中糖转运蛋白基因功能对阐明甘蔗体内糖分运输、积累机制及甘蔗品质遗传改良具有重要意义。

植物中糖转运蛋白家族基因（sugar transporter gene family，ST）属于易化扩散超家族（major facilitator super family，MSF），易化扩散超家族蛋白具备典型的12跨膜结构［2］。目前已鉴定的MSF超家族糖转运蛋白基因包括蔗糖转运蛋白家族基因（sucrose transporter family，SUT） 和 单糖 转 运蛋白家族基因（monosaccharide transporters family，MST）［3］。单糖转运蛋白家族基因包括糖转运蛋白基因（sugar transporters，STPs）、己糖转运蛋白基因（hexose transporters，HXTs）、质体葡萄糖转运蛋白基因（plastidic glucose transporters，pGlcTs）、液泡葡萄糖转运蛋白基因（vacuolar glucose transporters，VGTs）、液泡膜单糖转运蛋白基因（tonoplast monosaccharide transporters，TMTs）、肌醇转运蛋白基因（inositol transporters，INTs/ITRs）、糖醇转运蛋白基因（polyol transporters，PLTs/PMTs）、糖运输蛋白基因（sugar-porter family protein，SFPs）［4］。

植物中蔗糖转运蛋白家族基因数量较少，单糖转运蛋白基因家族数量较多，糖转运蛋白负责多种糖的装载和卸载［5-6］。STPs单糖转运蛋白，是一类位于细胞膜的具备12跨膜结构的H+/糖同向转运膜蛋白［7-8］。STPs是单糖转运蛋白家族基因中目前功能鉴定较多的一类糖转运蛋白，具备广谱的底物糖吸收特性，如葡萄糖、戊糖、木糖、核糖、半乳糖、果糖、甘露糖等［7，9-10］，在不同的组织/器官及不同胁迫条件下表达模式不同。对拟南芥、水稻中的多个STPs家族基因功能分析结果表明STPs在植物糖分运输、生长发育、胁迫抗性等多个生理学过程中发挥重要作用［10-11］，目前甘蔗中STPs基因功能还不清楚。研究表明在甘蔗割手密种基因组中发现105个糖转运蛋白基因，其中有35个STPs糖转运蛋白基因，割手密STP7基因表达响应糖饥饿信号诱导［12］。本研究进一步从栽培种甘蔗ROC22植株叶片中分离出单糖转运蛋白ShSTP7基因，并对其生物信息学特征、编码蛋白生物学特性、基因表达模式、亚细胞定位情况进行系统分析，为阐明甘蔗体内STP单糖转运蛋白基因的功能及甘蔗遗传改良提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 本试验所用甘蔗品种ROC22（蔗糖分：132.3 mg/g）、高糖热带种28NG251（蔗糖分：145.2 mg/g）、低糖品种MUCK CHE（蔗糖分：23.4 mg/g），种植于海口中国热带农业科学院热带生物技术研究所实验基地。

1.1.2 菌株与试剂 本试验所用大肠杆菌感受态菌株DH5α购自北京全式金生物公司，pMD-19T克隆载体、LA taq酶、Real time PCR试剂购自TaKaRa生物公司，RNA提取试剂盒购自Omega公司，cDNA第一链反转录试剂盒、T4连接酶、快速限制性内切酶购自Fermentas生物公司。质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自Axgen公司。

1.2 方法

1.2.1 甘蔗总RNA提取及cDNA第一链合成 分别称取叶和茎节不同部位（未成熟叶片取未完全伸展幼嫩叶片计0叶；成熟叶片取完全伸展叶片从上至下计数+3叶；茎节取样以茎尖生长点计为0，向下依次从第1节开始计数）的组织100 mg在液氮中充分研磨成粉末，然后根据Omega植物RNA提取试剂盒步骤提取甘蔗组织中的总RNA，提取完成的总RNA置于-80℃保存备用，提取质量经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计吸光值进行纯度检测。cDNA合成按照Fermentas RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书步骤进行反转录，合成cDNA放于-20℃保存备用。

1.2.2 甘蔗ShSTP7基因全长序列扩增及测序 以甘蔗转录组测序数据序列为基础，设计ShSTP7全长扩增引物（表1），以甘蔗叶片cDNA为模板进行ShSTP7全长序列扩增。PCR反应体系为：buffer 25 μL，dNTP 4 μL，引 物 P1/P2 各 1 μL，cDNA 1 μL，LA taq 0.6 μL，ddH2O 14.4 μL。PCR 扩增程序为：95℃ 5 min ；95℃ 1 min，58℃ 2 min，72℃ 2 min，35 cycles；72℃ 15 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，对目的条带使用试剂盒进行胶回收，并用TA克隆连入pMD-19T后转化DH5α感受态细胞，对阳性菌落送上海生物工程生物公司进行测序。

1.2.3 甘蔗ShSTP7基因生物信息学分析 测序获得的序列需进行核酸同源性分析、阅读框ORF分析、编码氨基酸序列分析及编码蛋白特性及遗传进化树分析。核酸同源性分析（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast），ORF 分析（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html），编码氨基酸序列同源性分析（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast），利用 ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）和 TMHMM Serverv.2.0 在线软件预测ShSTP7基因编码蛋白质等电点、分子量及跨膜结构，利用MEG 4.0软件进行进化树构建。

1.2.4 甘蔗中ShSTP7基因表达分析 以Real time PCR技术分析8月龄甘蔗植株未成熟叶、成熟叶、1-3茎节、4-5茎节、9-10茎节、16-17茎节、19-20茎节中的ShSTP7表达模式。以甘蔗GADPH作为内参基因［13］，ShSTP7和GADPH qPCR扩增引物见表1。qPCR反应体系为：2 × SYBR PremixEx TaqTM，10 μL ；引物 P1/P2（4 μmol/L）各 2 μL ；50 × ROX Reference Dye，0.4 μL ；cDNA，1 μL ；ddH2O，6.6 μL。反应程序为试剂盒推荐程序，设3个技术重复，3个生物学重复。结果以2-ΔΔCt法计算相对定量值［14］。

1.2.5 甘蔗ShSTP7-GFP融合表达载体构建 设计ShSTP7基因阅读框扩增引物，下游引物去除终止子（表1），并以含有ShSTP7全长序列的质粒为模板进行ORF序列扩增，PCR反应体系及程序同上，PCR扩增产物经电泳切胶回收。将pCAMBIA1302载体用Spe I单酶切线性化后进行凝胶电泳后切胶回收。将ShSTP7 ORF片段与载体片段通过无缝克隆技术进行连接，然后转化大肠杆菌感受态细胞，选取阳性克隆提取质粒进行酶切验证，形成ShSTP7-GFP融合表达载体，并送测序以验证连接片段序列正确。

表1 引物序列设计及用途Table 1 Design and application of primers

1.2.6 甘蔗ShSTP7在水稻叶片原生质体中的亚细胞定位 取7-15 d大小的水稻幼苗茎叶，按照Yoo等［15］方法进行原生质体提取及ShSTP7-GFP融合质粒的转化及瞬时表达，并用激光共聚焦显微镜观察定位结果并拍照。

2 结果

2.1 甘蔗总RNA纯度鉴定结果

本试验中不同甘蔗组织提取的RNA均经过琼脂糖凝胶电泳和吸光值检测。电泳结果显示所提总RNA 28S、18S条带完整清晰可见，没有明显降解，且A260/A280为1.8-1.9，表明所提总RNA质量好，可用于进一步的试验。

2.2 甘蔗ShSTP7基因cDNA序列克隆

以甘蔗叶cDNA为模板进行ShSTP7序列PCR扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后发现，在1 500 bp-2 000 bp之间存在一条特异的条带（图1），经胶回收连接转化测序后获得1 619 bp ShSTP7 cDNA序列。

图1 甘蔗ShSTP7 cDNA序列PCR扩增电泳图Fig.1 PCR amplification electrophoresis of sugarcane ShSTP7 cDNA

2.3 甘蔗ShSTP7基因生物信息学分析

对ShSTP7基因cDNA核酸序列进行blast同源比对发现，与高粱STP7同一率达98%，与玉米STP7同一率达95%，与水稻STP7同一率达91%。对1 619 bp ShSTP7序列进行分析发现，其中包含1 557 bp完整阅读框，编码518个氨基酸。利用ProtParam软件对ShSTP7编码氨基酸序列进行预测分析发现编码蛋白相对分子量55.6 kD，理论等电点pI为9.25，富含亮氨酸（12.2%）、丙氨酸（11.0%）、甘氨酸（10.4%）、缬氨酸（8.5%）、异亮氨酸（6.4%）、苯丙氨酸（6.2%）、丝氨酸（6.0%）等，不稳定系数38.55，是一种稳定蛋白。

利用TMHMM软件对ShSTP7编码蛋白跨膜结构域进行分析发现ShSTP7具有12个跨膜结构域，跨膜螺旋位于27-51位、85-104位、115-139位、144-162位、171-190位、205-224位、288-312位、325-344位、353-372位、387-411位、426-450位、455-474位，是一种膜蛋白（图2-B）。氨基酸同源序列比对发现ShSTP7编码蛋白氨基酸序列与甘蔗属割手密STP7同源性达到99%，与高粱、玉米STP7同源性达到98%和96%，与双子叶拟南芥STP同源性为78%，属于MFS超家族，在231-283位氨基酸处含有MFS家族STP糖转运蛋白保守结构域（图2-A）。根据不同植物物种间STP7单糖转运蛋白遗传进化树聚类分析表明，ShSTP7与割手密SsSTP7、高粱SbSTP7聚为一小类，杂交种甘蔗ShSTP7是SsSTP7和SbSTP7的进化类型，ShSTP7与其它禾本科作物STP7单糖转运蛋白聚为一大类（图2-C）。

图2 甘蔗ShSTP7氨基酸序列同源性（A）、跨膜结构（B）及遗传进化树分析（C）Fig.2 Amino acid sequence homology（A），transmembrane structure（B）and phylogenetic tree analysis（C）of sugarcane ShSTP7

2.4 甘蔗ShSTP7基因表达模式分析

对栽培种甘蔗ROC22植株不同组织中的ShSTP7表达模式进行分析发现，ShSTP7主要在甘蔗叶片中表达，特别是在成熟叶片中的相对表达量最高，茎节中表达量低（图3-A）。进一步对高糖（28NG251）和低糖（MUCK CHE）热带种甘蔗不同组织中ShSTP7的表达量进行分析发现，在高糖热带种叶片和第4-24茎节中ShSTP7的表达低于低糖热带种，而在高糖热带种茎尖第1-3节幼嫩茎节中的ShSTP7的表达略高于低糖热带种（图3-B）。

图3 不同甘蔗品种中ShSTP7表达模式分析Fig.3 Expression pattern analysis of ShSTP7 in different sugarcane cultivars

2.5 甘蔗ShSTP7-GFP融合蛋白亚细胞定位分析

采用无缝连接技术将去除终止子的ShSTP7基因阅读框序列连入没有起始密码子的GFP序列的N端，形成ShSTP7-GFP融合表达载体，经酶切证实插入序列大小与目的片段大小一致（图4-A），测序证实插入序列没有发生突变或移码。进一步将pCAMBIA1302空载体和ShSTP7-GFP融合表达载体在水稻叶肉细胞原生质体中进行瞬时表达发现，仅含有GFP的空载体在细胞核、胞质、细胞膜中均出现绿色荧光定位信号，而ShSTP7-GFP融合蛋白绿色荧光信号仅存在于细胞膜区域（图4-B），证实ShSTP7是一种细胞膜定位蛋白。

图4 甘蔗ShSTP7-GFP融合蛋白水稻叶肉细胞原生质体亚细胞定位结果Fig.4 Subcellular location result of ShSTP7 -GFP fusion protein in protoplast of rice mesophyll cells

3 讨论

从ROC 22叶片中克隆获得ShSTP7含有完整阅读框的cDNA序列，对其编码蛋白生物信息学分析结果表明，ShSTP7基因编码蛋白质属于MFS超家族STP家族成员，具有MFS超家族典型的12跨膜结构，含有MFS-STP单糖转运蛋白保守结构域，ShSTP7与近源种割手密、高粱、玉米STP7高度同源，遗传进化树结果显示甘蔗ShSTP7与单子叶禾本科作物STP7亲缘关系较近，与双子叶植物拟南芥中STP7亲缘关系较远，这些研究表明甘蔗ShSTP7编码一个单糖转运蛋白。植物中单糖转运蛋白的不同亚细胞定位决定着它们的作用部位，已有研究表明植物中单糖转运蛋白定位于细胞膜、液泡膜、质体膜中，分别负责质外体、液泡、质体中单糖的转运［4］，在水稻原生质体细胞瞬时表达ShSTP7-GFP融合蛋白表明ShSTP7为一种细胞膜定位单糖转运蛋白，可能参与吸收质外体空间中的单糖，与其它植物中报道的 STPs定位结果一致［4，16］。

已有研究表明拟南芥基因组中有14个STPs家族基因［4］，木薯基因组中有20个STPs家族基因［17］，玉米中有 23 个 STPs［11］，高粱中有 22 个STPs［11］，水稻中有 28 个 STPs家族基因［8］，甘蔗割手密基因组中有35个STPs家族基因［12］，植物中STPs家族成员基因表达模式不同，表明不同类型STPs在植物中所起作用不同。拟南芥中AtSTP2、AtSTP6、AtSTP9、AtSTP11在花粉中特异表达［9］，AtSTP4在花粉、叶、根中表达［9］，AtSTP1在萌发的种子、幼苗根中高表达［18］，AtSTP7在根、叶、花、花药中均有表达［16］，这些STP单糖转运蛋白基因在库组织中表达，表明它们在库组织的发育过程中起重要作用。AtSTP13和AtSTP14在源叶中表达［9］，表明它们参与源叶中质外体己糖吸收。水稻中OsSTP4、OsSTP8、OsSTP19在不同组织中组成型表达，OsSTP3、OsSTP10、OsSTP14主要在根中表达，OsSTP13、OsSTP20、OsSTP26 在未成熟叶中高表达［8］。木薯中的MeSTPs主要在储藏块根中表达［17］，表明STPs在木薯块根营养生长及糖分积累方面发挥重要作用。已有研究表明割手密和热带种甘蔗中STP7主要在叶片中表达，受糖饥饿诱导表达，而其共表达调控网络却出现了差异［12］，本研究对含热带种血缘栽培种甘蔗ROC22中的ShSTP7表达模式进行分析，研究表明ShSTP7同样主要在叶片中高表达，尤其是成熟叶片，表明甘蔗中单糖转运蛋白STP7主要在叶片糖分装载过程发挥重要作用。而已有的甘蔗单糖转运蛋白研究表明ShPST2a、ShHXT4、ShHXT6均为库组织表达特性［19-21］。进一步研究结果显示高糖热带种甘蔗叶片和4-24茎节中的STP7表达量低于低糖品种，已有研究表明植物中STPs单糖转运蛋白基因主要在涉及存在质外体单糖吸收部位表达，在主要以蔗糖吸收利用为主的组织中表达较低或没有表达，如在拟南芥发育的种子中没有STPs的表达［9］，表明在甘蔗高糖品种幼嫩茎节中STP7高表达有利于糖分的快速利用，在叶片和蔗糖积累茎节中的低表达可能促进蔗糖积累。

甘蔗作为一种产糖作物，糖转运蛋白基因直接调控甘蔗糖分积累及品质形成。植物中糖转运蛋白基因家族中关于蔗糖转运蛋白基因功能研究较单糖转运蛋白基因功能深入，甘蔗割手密基因组中仅存在6个蔗糖转运蛋白基因［22］，而存在105个单糖转运蛋白基因［12］，表明在甘蔗自然进化及人工选择过程中，单糖转运蛋白基因必然在维持甘蔗高糖种性扮演着重要角色，因此本研究在前期对甘蔗蔗糖转运蛋白ShSUT4基因［23］、单糖转运蛋白基因ShPST2a、ShHXT4、ShHXT6 功能研究基础上［19-21］，进一步对甘蔗STP单糖转运蛋白基因功能进行研究，可为建立甘蔗糖转运模型及揭示甘蔗糖分积累机制奠定基础，为甘蔗产量和品质遗传改良提供新的基因资源。

4 结论

从甘蔗中克隆到一个ShSTP7单糖转运蛋白基因，编码一个518个氨基酸的蛋白ShSTP7，相对分子量55.6 kD，理论等电点9.25，含有12个跨膜结构域和糖转运结构域，ShSTP7是一种细胞膜定位单糖转运蛋白，ShSTP7基因主要在甘蔗叶片中表达，且在高糖品种叶片中的表达低于低糖品种，表明甘蔗中ShSTP7可能负责质外体中单糖的吸收，在甘蔗叶片糖分吸收及转运过程中发挥重要作用。