MFG-E8作为外泌体载体蛋白的作用与功能

黎智康 刘晨雪璇 谭楚敏 熊盛，2 谢秋玲

（1.暨南大学生命科学技术学院，广州 510632；2.基因工程药物国家工程研究中心，广州 510632）

外泌体（exosomes）是一种直径在30-100 nm左右，具有脂质双分子层结构的内源性囊泡，包含蛋白质、脂质和核酸等内容物。外泌体能被几乎所有的细胞分泌，并存在于血液、尿液、乳汁和羊膜液等体液中［1］，在细胞通讯和疾病的诊断方面发挥着重要作用。此外，由于外泌体的生物相容性好，能够穿透血脑屏障以及在机体循环中具有较长的半衰期［2］，因此近年来，外泌体作为药物载体成为了外泌体领域的一个研究热点。

外泌体可以装载包括核酸、小分子和蛋白类药物在内的多种物质［3-4］，其中，对于外泌体装载蛋白质的方法有直接和间接两种。直接装载通过物理、化学方法将外源蛋白质载入外泌体中，该方法操作简单，但存在装载率低、影响蛋白质活性等缺点［5］。间接装载将目的蛋白基因转染供体细胞，使其在细胞内进行重组表达，蛋白在外泌体分泌过程中被包裹进去［6］。关于胞内蛋白分选进入外泌体的机制主要有两种，即内吞体分选转运复合体（ESCRT）依赖机制和ESCRT非依赖机制［7］。ESCRT依赖机制涉及TSG101和ALIX等蛋白的分选［8］，ESCRT非依赖机制则与四跨膜蛋白（如CD81等）的分选相关［9］，但两种分选机制的确切情况尚未被阐明，因而间接装载的方法难以控制蛋白质的装载过程和装载量［10］。所以目前在使用间接方法时，往往把目的蛋白与外泌体膜蛋白融合表达，如CD63、CD9等［11-12］，利用这些膜蛋白将目的蛋白定向带入外泌体中。

乳脂肪球表皮生长因子Ⅷ（milk fat globule epidermal growth factor 8，MFG-E8）是最初在乳房上皮细胞中发现的亲脂性糖蛋白［13］，是乳脂球膜（milk fat globule membrane，MFGM）中最主要的蛋白质之一。研究发现，人源的MFG-E8有3个结构域，即EGF-L、C1和 C2结构域［14］。MFG-E8能促进巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬作用，并在血管生成、自身免疫疾病和肿瘤中扮演着重要的角色［15］。此外，外泌体上含有MFG-E8［16］，且MFG-E8还能够黏附在细胞膜上，具有运载目的蛋白的潜力，因此考虑将其作为载体蛋白。

本研究通过构建人源MFG-E8不同结构域组合的截短体质粒，并融合表达绿色荧光蛋白，在HEK293F细胞中表达，收集其分泌的外泌体，观察各组分将EGFP带入外泌体的情况。用外泌体转染HEK293T细胞，进一步探讨MFG-E8各结构域的功能，为深入了解MFG-E8作为外泌体载体蛋白提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

HEK293F细胞由南开大学惠赠、HEK293T细胞为本实验室保存；转染试剂PEI购自Polysciences公司；Anti-EGFP Mouse mAb和 Anti-CD9 Rabbit mAb购自Abcam公司、Anti-mouse GAPDH购自Cell signaling technology公司；荧光染料DAPI和DIL购自Beyotime公司；质粒大抽试剂盒购自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 构建MFG-E8及其截短体的重组质粒 以质粒pCMV为载体，构建人源MFG-E8全长及其不同截短体（图1-A），分别为C1C2、EFG-L-C1（EC1）、EFG-L-C2（EC2）、C1、C2 和 EFG-L，MFG-E8 和系列截短体的5′端保留信号肽，在3′端加入Linker连接有荧光蛋白EGFP，以便后续对MFG-E8各结构域在细胞中的定位进行观察。PCR扩增各截短体的基因序列，酶切，对上述MFG-E8及其截短体目的基因进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，并进行测序。

1.2.2 重组质粒的表达与外泌体的提取鉴定 以1∶2的 DNA∶PEI比例和 1 μg/106的质粒浓度对HEK293F细胞进行转染。转染前，对细胞进行传代，细胞数量保持每皿1×106个细胞，且细胞活率在90%以上。

采用超速离心法提取外泌体，细胞培养液先4℃，300×g离心10 min，弃沉淀。然后分别在2 000×g、10 000×g下各离心30 min，弃去亚细胞沉淀。最后以100 000×g离心70 min获得外泌体沉淀，用适当PBS重悬后过0.22 μm滤膜，保存于-80℃备用。

取少量外泌体，用透射电镜观察外泌体形态。同时，对提取所得的外泌体进行NTA粒径分析。

1.2.3 纳米颗粒跟踪分析（NTA） 取少量外泌体，用 PBS将其稀释到（1×108）-（1×109）particles/mL，用NS300仪器对外泌体进行粒径分析。

1.2.4 Western blot检测 转染HEK293F细胞4 d后，离心收集细胞培养液的上清和沉淀。以上清液、细胞沉淀和提取的外泌体为样品，分别加入上样缓冲溶液，在12% SDS-PAGE胶中电泳，随后300 mA转膜1 h，加入5%脱脂牛奶封闭1 h，一抗anti-EGFP（1∶5 000）4℃ 孵育过夜，用TBST洗膜3次，每次5 min，加入二抗孵育1 h，同样洗膜3次后在膜上滴加发光显影液，用凝胶成像系统观察蛋白表达与存在情况。

1.2.5 激光共聚焦显微镜观察截短体的细胞定位 将 pCMV-MFG-E8-EGFP、pCMV-EGF-L-EGFP、pCMV-EC1-EGFP、pCMV-C1C2-EGFP四种重组质粒瞬转HEK293F细胞后48 h，离心收集以上4种细胞和未转染载体的HEK293F细胞（作为空白对照），用4%多聚甲醛固定15 min，使用PBS清洗后加入0.25% TritonX-100通透液孵育15 min，再次用PBS清洗后用不同染料（DAPI：核染料、DIL：膜染料）分别孵育5 min。最后经PBS清洗、重悬细胞，放入共聚焦皿，滴加少量抗荧光淬灭剂，置于激光共聚焦显微镜下观察。

1.2.6 电镜观察外泌体中的目的蛋白 为了能更直观地观察外泌体上目的蛋白的存在位置，将分别含有MFG-E8-EGFP、EC1-EGFP和C1C2-EGFP的3种外泌体与偶联EGFP抗体的胶体金颗粒4℃ 孵育过夜，之后将样品滴在铜网上，风干置于电镜下观察。

1.2.7 外泌体转染HEK293T细胞 将含有EGFP的外泌体等量加入HEK293T细胞培养液中，经过3 h孵育后，用胰酶消化，离心细胞，PBS清洗，于荧光显微镜下观察绿色荧光的位置情况。

2 结果

2.1 MFG-E8及其截短体表达载体的构建

设计不同缺失的截短体（图1-A），构建包括全长MFG-E8在内的7种重组质粒，统一在5′端保留信号肽，在3′端加入Linker连接有荧光蛋白EGFP。琼脂糖凝胶电泳结果显示与各目的基因预期大小相一致（图1-B），测序结果也完全正确。MFG-E8及其截短体重组质粒构建成功。

图1 MFG-E8-EGFP及截短体结构及酶切鉴定凝胶电泳图Fig.1 Structure of MFG-E8-EGFP and its truncated forms as well as gel electrophoresis plots for identification by enzyme digestion

2.2 MFG-E8及其截短体在HEK293细胞上的表达

将构建成功的质粒转染HEK293F细胞，2 d后用流式细胞分析仪检测蛋白表达情况。流式结果显示，截短体C1C2和C2的瞬转效率较低，分别为44.43%和32.66%，其他重组质粒的瞬转效率均超过50%，其中EGF-L的瞬转效率最高，为76%（图2-A）。说明EGF-L的表达最高，而C1C2和C2的表达量较低。

图2-B显示了WB检测目的蛋白在胞内的表达情况，根据分子量大小，各截短体在细胞内均有表达，其中EGF-L表达量最高，C2最低。从图2-C可以看出，在上清液中只检测到EGF-L、C1和EC1的表达，其中EGF-L表达量远大于C1、EC1，说明只有这3种蛋白可以分泌到胞外，其他蛋白虽然带有信号肽却没有分泌到培养上清中。

图2 重组质粒瞬转效率和表达情况的检测Fig.2 Detection of the transient efficiency and expression of the recombinant plasmids

2.3 MFG-E8蛋白各组分在细胞上的定位

为了进一步检测表达的几种重组蛋白所在的细胞定位，对转染pCMV-MFG-E8-EGFP、pCMV-EGFL-EGFP、pCMV-EC1-EGFP、pCMV-C1C2-EGFP四种重组质粒的HEK293F细胞进行激光共聚焦显微镜观察。结果（图3）表明，转染MFG-E8-EGFP和C1C2-EGFP重组质粒的细胞在膜上都有较强的绿色荧光信号，显示目的蛋白存在于细胞膜上。转染EC1-EGFP的细胞仅有微弱的绿色荧光，荧光呈现点状围绕细胞膜。转染EGF-L-EGFP的细胞其绿色荧光分散地分布在细胞中，与其他组绿色荧光位置相比较，该组荧光没有成环状，提示EGF-L-EGFP不在细胞膜上，而是存在于细胞质当中。这与此前WB结果相一致，EGF-L既表达分布在胞内，也可以分泌到培养上清中，但带有C1C2或C2的蛋白虽然也有信号肽，却黏附于膜上，不能分泌到培养上清中。

图3 激光共聚焦显微镜检测MFG-E8及其截短体在细胞中的定位Fig.3 Location detection of MFG-E8 and its truncated proteins in HEK293 cells by laser confocal microscopy

2.4 外泌体的提取鉴定

利用超速离心法得到转染了重组质粒的HEK293F细胞分泌的外泌体。电镜观察结果如图4-A，可以见到杯状或球状的半透明囊泡样结构，该结构具有与细胞膜相同的双层膜结构。NTA粒径分析结果表明所提取的颗粒大小在80-150 nm之间，属于外泌体的粒径范围内（图4-B）。据此，可以推断超速离心所得沉淀大部分为外泌体。

图4 外泌体的电镜结构和粒径分析Fig.4 Transmission electron micrograph and size distributions of exosomes

2.5 MFG-E8及其各组分在外泌体中的定位

对转染了7种重组质粒的细胞进行外泌体提取，以CD9为外泌体的标志物，使用EGFP抗体，WB检测MFG-E8和各截短体在外泌体中的存在情况。如图5-A所示，在外泌体中仅有MFG-E8-EGFP、C1C2-EGFP和EC1-EGFP被检测到，而且MFG-E8-EGFP的表达量高于后两者，其他截短体则没有在外泌体中发现。此结果表明，MFG-E8、C1C2、EC1能将EGFP携带到外泌体中，但携带效率不尽相同，而其他几种蛋白难以有效携带目的蛋白进入外泌体中。

将外泌体与偶联了EGFP抗体的金颗粒孵育，利用电镜进一步观察上述3种外泌体上EGFP的存在情况（图5-B），发现3种外泌体上均可以观测到目的蛋白的存在。由于偶联了EGFP抗体的金颗粒无法进入外泌体内部，表明荧光蛋白EGFP位于外泌体的外层膜上。3种外泌体中，MFG-E8-EGFP结合的金颗粒较EC1-EGFP和C1C2-EGFP多，说明全长MFG-E8所携带的目的蛋白最多，该结果与之前WB结果相符合。

图5 EGFP在外泌体中存在情况的鉴定Fig.5 Identification of EGFP in exosomes

2.6 外泌体转染293T细胞

将含有MFG-E8-EGFP、EC1-EGFP和C1C2-EGFP的3种外泌体转染HEK293T细胞后，用荧光显微镜观察发现3种外泌体转染HEK293T细胞后，转染细胞均有观测到绿色荧光信号（图6），说明3种外泌体都可以将目的蛋白带入受体细胞，外泌体可以很好地起到载药功能。其中装载MFG-E8-EGFP外泌体转染后的细胞的荧光强度最高，另外两组细胞的荧光强度较弱，与此前检测外泌体中EGFP含量结果一致。

图6 荧光显微镜观察外泌体转染效果Fig.6 Fluorescence images showing the effect of exosomes transfection

3 讨论

MFG-E8作为乳脂球膜上一种重要的亲脂性糖蛋白，能够通过增强凋亡细胞的吞噬调节炎症和自身免疫，缺乏MFG-E8的小鼠会引起自身免疫疾病的出现［17-19］。人源MFG-E8由3个结构域组成，其中的EGF-L结构域含有的RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）序列能够与整合素 αvβ3/αvβ5靶向结合介导细胞间的黏附［20-22］，因此，MFG-E8具有一定的靶向潜能。MFG-E8羧基端的盘状结构域C1C2则能通过磷脂酰丝氨酸（PS）与细胞建立联系。另外，MFG-E8被发现存在于细胞外囊泡中，已有研究报导，通过MFG-E8的C1C2结构域与外源蛋白融合表达，从而实现外泌体对外源蛋白的装载［23］。

虽然C1C2已被用来作为导向外泌体的载体蛋白，但MFG-E8各结构域对外泌体包载其融合表达目的蛋白效率是否有影响还有待研究，因此本研究构建了连接有信号肽的MFG-E8全长和不同截短体与EGFP融合表达的重组质粒，在真核细胞里表达，检测目的蛋白在细胞及其分泌的外泌体上的表达情况和所在位置。

研究发现，MFG-E8及其各组分均存在细胞中，其中EGF-L的表达量最高，C2的表达量最低，而上清中仅检测到EGF-L、C1和EC1的存在。这说明具有C1C2，尤其是C2的存在，对蛋白在膜上的黏附作用具有重要影响。同时，激光共聚焦显微镜观察到MFG-E8、C1C2和EC1定位在细胞膜上，而EGF-L的荧光分散在细胞质内。这与之前有关C1、C2结构域的功能的研究相一致，有文献报道C2结构域内的茎环结构可能与膜连接［24］，而且单独的C2结构域与全长的MFG-E8对于磷脂酰丝氨酸有相近的亲和力［25］，而C1结构域能够加强C2结构域与磷脂酰丝氨酸的连接作用［26-27］。

而外泌体中只有MFG-E8、C1C2和EC1三种蛋白被检测到，其表达量为MFG-E8＞EC1＞C1C2，这说明MFG-E8各结构域作为载体将目的蛋白带入外泌体必须有C1或者C2的存在，因为C1、C2结构域是与膜连接的部分，这与文献中的报导相符［28］，而EGF-L结构域的存在可以促进融合蛋白表达量的增加，C1C2或C2连接的蛋白融合表达量都很低，从而也会影响到其携带入外泌体的量。我们的实验还发现MFG-E8、C1C2和EC1所携带的蛋白是位于外泌体膜外的，因而可以利用其作为载体蛋白，携带需与细胞膜上受体结合的蛋白质，或者携带抗原蛋白，打造有潜力的蛋白疫苗。

4 结论

本研究通过构建MFG-E8及其不同的截短体，对MFG-E8各结构域将蛋白载入外泌体的作用进行探究。MFG-E8在细胞中表达后能黏附在细胞膜上，C1C2结构域在此过程中发挥锚定细胞膜作用，可将目的蛋白带到外泌体上，而EGF-L结构域可提高蛋白表达，进而影响外泌体中目的蛋白的含量。